固相竞争ELISA 和液相阻断ELISA在口蹄疫抗体检测中的比较

李晓丽，佟虎成，邱 晨

承德市动物疫病预防控制中心，河北承德 067000

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）感染偶蹄动物而引起的一种急性、热性、高度传染的一类动物疫病，可造成巨大的经济损失和社会影响，被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的动物传染病。口蹄疫病毒主要通过直接或间接接触（飞沫等）的方式传播，如果环境气候适宜，病毒可随风远距离传播，这种传播方式为口蹄疫的控制和根除带来了极大的困难，因此，现阶段疫苗免疫仍然是防控口蹄疫的最主要措施，我国也一直将口蹄疫作为国家强制免疫病种。血清学检测是对血清中特异性抗体的鉴定和定量，免疫抗体监测是评估免疫效果的有力手段，在口蹄疫诊断检疫中应用最广，免疫抗体检测方法的敏感性和特异性显得尤为重要。2004 年OIE 公布的口蹄疫血清学检测方法有三种，分别是病毒中和试验（VNT）、液相阻断ELISA（LPB-ELISA）方法和固相竞争ELISA（SPCELISA）方法，其中，病毒中和试验是最经典的方法，同时也是评价其他方法的黄金标准。酶联免疫吸附试验（ELISA）因具有敏感、特异、稳定、安全、快速、易于操作等特点而备受青睐，液相阻断ELISA 方法以其高度的敏感性、特异性和较好的稳定性，得到国际上的一致认可，在口蹄疫免疫抗体检测、动物免疫状况评估和血清学调查等工作中广泛应用。

固相竞争ELISA 2004 年被OIE 确立为口蹄疫血清学调查的最新推荐方法，我国的国家标准《口蹄疫诊断技术》GB/T 18935-2018 版与GB/T 18935-2003 版相比，也增加了固相竞争ELISA 检测方法，同时，《2022 年河北省主要动物疫病监测和流行病学调查计划》首次将固相竞争ELISA 方法列为口蹄疫免疫抗体检测方法。固相竞争ELISA属于ELISA 三个基本类型（夹心法、间接法和竞争法）中的竞争法。基本原理为，首先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原，再加入样本和酶标抗体进行竞争结合反应，如果样本中的抗体量越多，那么结合在固相上的酶标抗体就越少，因此，阳性反应呈色会浅于阴性反应呈色。

本文在口蹄疫免疫抗体检测过程中，对液相阻断ELISA 和固相竞争ELISA 两种检测方法在检测时间和检测结果两方面进行了比较，以期更好的为口蹄疫防控工作服务。

1 材料

1.1 样品

承德市各县区动物疫病预防控制中心送检的猪血清样品345 份、牛血清样品110 份、羊血清样品159 份，共614 份，所有样品均来自近期免疫过口蹄疫O-A 二价灭活苗的家畜。

1.2 试剂盒

口蹄疫A型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒（改进型）（批号：20220511134-1）和口蹄疫O 型液相阻断ELISA 抗体检测试剂盒（改进型）（批号：20220727133-3）购自兰州兽研生物科技有限公司；口蹄疫病毒A型固相竞争ELISA抗体检测试剂盒（批号：20220401）和口蹄疫病毒O 型固相竞争ELISA抗体检测试剂盒（批号：20220403）购自武汉某生物股份有限公司。

2 方法

严格按照试剂盒说明书进行试验操作与结果判定，液相阻断ELISA 试剂盒采用50%抑制率进行血清滴度终点判断，固相竞争ELISA 采用样品OD 值与阴性对照OD 值之比进行阴阳性判断。液相阻断ELISA 方法采用20 份样品布局，首先在V 型血凝板上进行倍比稀释，猪血清稀释至1:4，牛羊血清稀释至1:8，后续在酶标板上按照说明书进行相应操作。

3 结果与分析

3.1 检测时间对比

除去洗板及操作时间，改进型液相阻断ELISA试剂盒共需要75 min，固相竞争ELISA 试剂盒共需要55 min。

3.2 检测结果对比

采用液相阻断ELISA 和固相竞争ELISA 方法同时对614 份血清样品进行O 型口蹄疫和A 型口蹄疫免疫抗体检测，O 型口蹄疫液相阻断ELISA 检测结果显示：有521 份样品为口蹄疫免疫抗体阳性，93份为阴性，以此作为参照标准，计算两种检测方法在检测O 型口蹄疫的符合率为95.3%（表1），同理，两种方法在检测A 型口蹄疫的符合率为96.1%，详见表1 和表2。

表1 O 型口蹄疫LPB-ELISA 和SPC-ELISA 的符合率

表2 A 型口蹄疫LPB-ELISA 和SPC-ELISA 的符合率

综上可以看出，两种方法符合率较高，检测A型口蹄疫的符合率稍高于O 型口蹄疫的符合率。

对不同畜种，两种检测方法检测O 型口蹄疫符合率进行比较，符合率未见显著差异，见表3。

表3 不同畜种O 型口蹄疫SPC-ELISA 与LPB-ELISA符合率

不同畜种两种检测方法的阳性检出率结果详见表4 和表5。

表4 LPB-ELISA 检测结果

表5 SPC- ELISA 检测结果

通过上表可知，两种方法的抗体阳性检出率无明显差别，总体来说，液相阻断ELISA 检出的抗体合格率稍高于固相竞争ELISA 检测结果。

4 讨论

本次检测，O 型口蹄疫和A 型口蹄疫免疫抗体水平普遍较高，说明我市口蹄疫防疫密度较大，防疫水平较高。

液相阻断ELISA 和固相竞争ELISA 检测的均不是中和抗体，只有病毒中和试验检测的是血清中的中和抗体滴度，被列为评价疫苗免疫能力的黄金标准，但是，因为病毒中和试验过程中需要使用活病毒[1]，一般的实验室达不到相应的生物安全标准，因此不能采用这种方法进行抗体检测，故常常采用其他检测方法来代替。李乐[2]等研究发现，液相阻断ELISA 抗体滴度与中和抗体滴度显著相关，相关性为0.642，同时，国家口蹄疫参考实验室做过的攻毒保护试验数据也显示，病毒中和试验与攻毒保护试验的相关性较高，而液相阻断ELISA 和病毒中和试验的相关系数大于0.8，属于高度相关[3]，所以本次试验以液相阻断ELISA 检测结果为参照标准，计算固相竞争ELISA 与之符合率。

液相阻断ELISA 试验所检测抗体阳性率比固相竞争ELISA 试验稍高，这与吕晓丽等人的检测结果相一致[4]。廖德芳等人发现固相竞争ELISA 更符合中和试验参比标准，液相阻断ELISA 在检测猪血清时表现为假阳性偏高。本试验没有发现液相阻断ELISA 阴性而固相竞争ELISA 阳性的样品，可能与本次检测样品数量偏少有关。

液相阻断ELISA 试剂盒成本相对较高，一块ELISA 板只能检测10 ～20 份样品，而固相竞争ELISA 试剂盒采用阴阳性判断免疫效果，可大大简化试验程序。虽然液相阻断ELISA 改进型试剂盒，大大降低了操作时间，但是仍需要进行血清倍比稀释，操作稍繁琐；固相竞争ELISA 试剂盒操作简单、时间短，在疫苗效果评估和血清抗体背景分析中，我们只需要知道动物是否具有口蹄疫抗体，而具体的抗体滴度意义并不大，因此在大规模免疫抗体检测时，推荐采样固相竞争ELISA 检测方法。