雷公藤甲素联合吉非替尼对EGFR突变NSCLC细胞的协同效应分析

张 艺 ，郭 芬 （1.咸宁市中心医院/湖北科技学院附属第一医院呼吸与危重症医学科，湖北 咸宁 437100；.湖北科技学院临床医学院医学实验实训中心，湖北 咸宁 437100）

肺癌是癌症致死的首要原因，其中约85%的肺癌为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），严重影响人类健康[1]。近年来，表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）编码基因分型的鉴定和EGFR 酪氨酸激酶抑制剂（EGFR tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）靶向药物的发展，极大地改变了EGFR基因突变晚期NSCLC患者的治疗结局[2]。然而，几乎所有的EGFR基因突变阳性患者都会在治疗1 年内对EGFR-TKIs 产生获得性耐药[3]，故探寻能够预防或克服EGFR-TKIs 耐药的治疗方案成为该领域的主要研究方向。

近期研究证实，某些天然药物成分可通过不同的信号通路来推迟或阻止EGFR-TKIs耐药的发生[4]。雷公藤甲素（triptolide，TPL）是从中药雷公藤中提取分离的一种二萜类化合物，具有显著的抗肿瘤活性，且在逆转化疗药物耐药方面具有一定潜力[5—6]，然而其具体机制尚不清楚。既往有研究证实，TPL可调节多种生物学过程关键蛋白的表达，且与磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，又称Akt）通路的关系尤其密切[7]；同时，PI3K/Akt通路与EGFR-TKIs 耐药的发生密切相关[8]。为此，本课题组基于PI3K/Akt 通路，以耐药细胞为对象，初步探索TPL 对第一代EGFR-TKIs 吉非替尼获得性耐药的抑制作用及潜在机制，旨在为进一步阐明TPL 的药理作用提供参考，亦为预防或逆转EGFR-TKIs 耐药提供候选治疗策略。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器包括BD Accuri C6 型流式细胞仪（美国BD Biosciences 公司）、XBQ-2H 型细胞培养仪（上海佐研仪器科技有限公司）、LD-96A型酶标仪（山东莱恩德智能科技有限公司）等。

1.2 主要药品与试剂

TPL对照品（批号111567-202005，纯度≥98%）购自中国食品药品检定研究院；吉非替尼片（批号211102，规格0.25 g）购自日本Kagamiishi Plant，Nipro Pharma Corporation。TPL 对照品和吉非替尼片均保存于二甲基亚砜（DMSO）中（最终质量浓度均为100 μg/mL），临用前以无血清培养基稀释至相应质量浓度。

RPMI 1640 培养基购自美国Gibco 公司；核糖核酸酶Ⅰ购自美国Sigma-Aldrich 公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）试剂购自北京百奥莱博科技有限公司；MTT试剂（批号c7062）购自北京博奥森生物技术有限公司；兔源PI3K p85α 单克隆抗体（批号ab191606）、兔源Akt3+Akt2+Akt1 重组单克隆抗体（批号ab32505）、小鼠源哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）单克隆抗体（批号ab87540）、兔源微管相关蛋白1 轻链3α（microtubule-associated protein 1 light chain 3α，MAP1LC3A）单克隆抗体（批号ab52768）、兔源MAP1LC3B 多克隆抗体（批号ab51520）、Alexa Fluor®488 标记的山羊抗兔IgG 二抗（批号ab150077）、Alexa Fluor®488 标记的山羊抗鼠IgG 二抗（批号ab96879）均购自英国Abcam公司。

1.3 实验细胞

人EGFR 低敏感性NSCLC 细胞系H1975（即EGFRT790M/L858R 突变的耐药细胞系）和高敏感性NSCLC细胞系H1299（即EGFR野生型的非耐药细胞系）均购自日本Riken细胞库。

2 方法

2.1 细胞培养

将H1299 和H1975 细胞置于含有10%胎牛血清、L-谷氨酰胺（2 mmol/L）、1%青霉素-链霉素双抗和25 mmol/L HEPES 缓冲液的RPMI 1640 培养基中，在37 ℃、5% CO2条件下培养。待细胞生长融合度达90%时，用0.25%胰酶消化并按照1∶3的比例传代继续培养，取传至第2代的细胞进行后续实验。

2.2 TPL、吉非替尼单用及两药联合对2种细胞敏感性影响的检测

待H1299和H1975细胞铺满培养皿60%左右时，取生长良好的细胞以2.5×105个/孔接种于6 孔板中，在37 ℃、5% CO2条件下培养（培养条件下同）。待细胞完全贴壁后，分为空白组（仅含细胞和培养液）、不同浓度TPL组（1、5、10、15、20、25、30 nmol/L，参考相关文献[6]和预实验结果设置）、不同浓度吉非替尼组（1、2、4、8、12、16、20 µmol/L，参考相关文献[7]和预实验结果设置）、不同浓度TPL+吉非替尼组（5 nmol/L TPL 分别联合2、5、10、20 µmol/L 吉非替尼，10 nmol/L TPL 分别联合2、5、10、20 µmol/L吉非替尼，参考前期MTT筛选结果设置），每组设6个复孔。弃去培养液，各药物组加入相应药液，空白组不作处理。培养24、48、72 h 后，收集各组细胞，加入5 mg/mL MTT 试剂20 μL，在37 ℃下孵育4 h，使用酶标仪于490 nm 波长处检测各孔的光密度（optical density，OD）值并计算细胞存活率：细胞存活率（%）＝药物组OD值/空白组OD值×100%。计算吉非替尼（作用24、48、72 h）的半数抑制浓度（IC50）和吉非替尼单用及两药联用（作用48 h）的药物敏感度指数（sensitivity index，SI）：SI＝ΔX/ΔY（式中，ΔX是细胞存活数，ΔY是正常细胞总数）。若SI＝1.0，表示细胞对药物的敏感性不明显；SI＞1.0，表示细胞对药物的敏感性较高；SI＜1.0，表示细胞对药物的敏感性较低[9]。采用中位药效法（Chou-Talalay法）计算TPL联合吉非替尼作用48 h的联合用药指数（combination index，CI）：CI＝d1/D1+d2/D2（式中，d1和d2分别为联合用药时吉非替尼和TPL的浓度；D1和D2分别为产生与联合用药相等效应时吉非替尼和TPL 单用的浓度）。CI＞1为两药拮抗，CI＝1为两药相加，CI＜1 为两药协同[6]；以受影响的细胞比例（Fa）为横坐标、CI为纵坐标绘制散点图，若Fa 为0.2～0.8 则表示药物有效[7]。

2.3 TPL 联合吉非替尼对H1975 细胞凋亡及周期分布影响的检测

取生长良好的H1975 细胞以2×105个/孔接种于6孔板中，培养，待细胞贴壁后，分为空白组（仅含细胞和培养液），低、高浓度TPL 组（5、15 nmol/L，参考“2.2”项下结果设置），吉非替尼组（2 μmol/L，参考“2.2”项下结果设置），低浓度TPL+吉非替尼组、高浓度TPL+吉非替尼组（5 nmol/L TPL+2 μmol/L 吉非替尼，15 nmol/L TPL+2 μmol/L 吉非替尼，参考“2.2”项下结果设置），每组设6个复孔。弃去培养液，各药物组加入相应药液，空白组不作处理。培养24、48 h后，收集各组细胞，并固定于冷的75%乙醇中，随后用含200 mmol/L Na2PO4和0.1% Triton X-100 试剂的DNA 缓冲液处理，再以含200 μg/mL核糖核酸酶Ⅰ的PI试剂染色，使用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率及周期分布情况。

2.4 TPL与EGFR分子对接分析

从PDB 蛋白质数据库（https：//www.rcsb.org/）加载EGFRT790M/L858R 突变型及野生型编码产物的晶体结构，去除水分子后，基于AMBER99 力场对其进行质子化处理；利用MMFF94s 力场优化TPL 的分子结构。利用MOE 分子对接软件模拟TPL 和EGFR 的结合位点。基于结合对接能量对TPL 的所有结合位点进行排序，并选择能量最低的构象进行结合模式展示。

2.5 TPL 联合吉非替尼对H1975 细胞PI3K/Akt/mTOR通路及自噬相关蛋白表达影响的检测

采用流式细胞术检测。取生长良好的H1975 细胞以2×105个/孔接种于6孔板中，培养，待细胞贴壁后，按“2.3”项下方法分组、干预。培养24、48 h后，收集各组细胞，分别用核因子固定液和渗透缓冲液固定和渗透，然后加入PI3K、Akt、mTOR、MAP1LC3A、MAP1LC3B 一抗（稀释比例均为1∶2 000），4 ℃孵育过夜；再加入相应二抗（稀释比例均为1∶1 000），孵育1 h。使用酶标仪检测并使用FlowJo V10 软件分析目的蛋白的荧光强度以表示其表达水平。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 TPL、吉非替尼单用及两药联合对2种细胞敏感性的影响

随着浓度的增加和时间的延长，TPL、吉非替尼对H1975 和H1299 细胞增殖的抑制作用逐渐增强，且具有浓度、时间依赖趋势（图1A、1B）。作用24、48、78 h 时，吉非替尼对H1975 细胞的IC50分别为15.10、11.67、7.31 μmol/L，对H1299 细胞的IC50分别为15.78、12.75、9.48 μmol/L。作用48 h 时，吉非替尼对H1975 细胞的SI 为0.73；与5 或15 nmol/L 的TPL 联用后，SI 分别升至1.88、2.30，提示联用后药物对H1975细胞的敏感性有所增加；此外，两药联合作用48 h 对H1975 细胞的CI 均小于1（Fa 约为0.5），提示两药联合对H1975 细胞的增殖具有协同抑制效应。但两药联用对H1299 细胞的CI 均大于1（Fa多低于0.2），提示两药联合对H1299细胞的增殖并无上述协同抑制效应（图1C、图1D）。

图1 TPL、吉非替尼单用及两药联用对2种细胞敏感性的影响（±s，n＝6）

3.2 TPL 联合吉非替尼对H1975 细胞凋亡及周期分布的影响

H1975细胞培养24 h或48 h时，各药物组细胞的凋亡率均较空白组显著升高（P＜0.05）。同时，与空白组比较，各药物组G0/G1期细胞的比例均显著升高，S期、G2/M期（仅高浓度TPL组作用48 h和联用组）细胞的比例均显著降低，且高浓度TPL组细胞的凋亡率及周期变化普遍较吉非替尼组，联用组较吉非替尼、TPL单用组，高浓度联用组较低浓度联用组更明显（P＜0.05）。结果见表1。

表1 TPL联合吉非替尼对H1975细胞凋亡率及周期分布的影响（±s，n＝6，%）

表1 TPL联合吉非替尼对H1975细胞凋亡率及周期分布的影响（±s，n＝6，%）

a：与空白组比较，P＜0.05；b：与吉非替尼组比较，P＜0.05；c：与低浓度TPL组比较，P＜0.05；d：与高浓度TPL组比较，P＜0.05；e：与低浓度TPL+吉非替尼组比较，P＜0.05。

组别空白组吉非替尼组低浓度TPL组高浓度TPL组低浓度TPL+吉非替尼组高浓度TPL+吉非替尼组培养24 h凋亡率11.32±2.25 27.52±2.33a 26.43±2.64a 38.93±6.56abc 46.69±2.64abcd 52.12±4.81abcde G0/G1期比例57.60±4.63 63.15±5.04a 64.58±7.41a 70.21±6.38ab 77.82±5.26abcd 85.69±6.42abcde S期比例21.49±2.60 16.31±1.41a 12.61±5.12a 10.96±4.58ab 6.63±1.24abcd 4.43±0.26abcde G2/M期比例10.71±1.03 9.86±0.42 12.48±5.45 11.32±2.10 7.12±1.49abcd 5.49±0.69abcde培养48 h凋亡率22.16±2.38 35.47±2.55a 35.33±3.51a 40.43±2.43abc 50.78±2.30abcd 62.54±3.66abcde G0/G1期比例61.23±8.21 65.20±4.23a 67.41±2.52a 74.61±6.23abc 85.79±4.73abcd 93.87±6.90abcde S期比例30.64±5.13 21.03±2.08a 22.75±5.00a 17.72±0.39abc 11.81±3.29abcd 7.24±0.58abcde G2/M期比例20.85±3.91 18.73±4.05 18.18±3.42 16.68±0.62a 9.80±2.44abcd 5.70±0.28abcde

3.3 TPL与EGFR分子对接分析

TPL 的羟基可与EGFRT790M/L858R 突变编码产物的Thr854 残基形成氢键，结合对接能量为-6.504 kcal/mol（1 kcal＝4.19 kJ）；而TPL 与EGFR野生型编码产物之间没有氢键，结合对接能量为-4.460 kcal/mol。结果见图2。

图2 TPL与EGFR T790M/L858R突变和EGFR野生型编码产物结合的二维模型

3.4 TPL 联合吉非替尼对H1975 细胞PI3K/Akt/mTOR通路及自噬相关蛋白表达的影响

与空白组比较，各药物组培养24、48 h 时通路相关蛋白PI3K、Akt、mTOR 的表达均显著下调，而自噬相关蛋白MAP1LC3A、MAP1LC3B的表达均显著上调，且高浓度TPL组上述指标的变化均较吉非替尼组，联用组较吉非替尼、TPL 单用组，高浓度联用组较低浓度联用组更明显（P＜0.05），结果见图3。

图3 TPL联合吉非替尼对H1975细胞PI3K/Akt/mTOR通路和自噬相关蛋白表达的影响（±s，n＝6）

4 讨论

吉非替尼是第一代EGFR-TKIs，可通过竞争性结合EGFR 结构域中的腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）位点而阻止酪氨酸磷酸化，阻断EGFR所介导的信号通路持续激活，从而发挥抗肿瘤作用，该药被广泛用于EGFR基因突变阳性NSCLC 患者的一线治疗[1，7—8]。然而临床实践显示，多数患者用药后不久便会发生EGFR-TKIs耐药，从而导致治疗失败[10—11]。

TPL 是一种具有强烈细胞毒性的环氧二萜内酯化合物，对乳腺癌、前列腺癌、肺癌等肿瘤细胞均有显著的抑制作用，还可增强5-氟尿嘧啶、顺铂、阿霉素等化疗药物的抗肿瘤作用，从而提高化疗药物的治疗效果[6，12]。本研究发现，不同浓度的TPL对H1975、H1299细胞的增殖有一定的抑制作用，且有时间和浓度依赖趋势。

药物相互作用评价在医药学各个领域都具有重要的价值，特别是在需联合用药的恶性肿瘤化疗领域，其中CI分析是评估化疗药物相互作用的常用指标之一，当Fa 值为0.2～0.8、CI＜1 则表示联用药物具有协同效应[6—7，13]。本研究结果显示，不同浓度的TPL联合吉非替尼可对H1975细胞的增殖产生协同抑制效应（Fa约0.5，CI＜1）；而两药联合对H1299 细胞几乎没有上述效应（Fa 多低于0.2，CI＞1），同时反映药物敏感度的SI 也从单用的0.73升至联用的1.88、2.30，可能是因为H1299细胞为吉非替尼敏感细胞，而H1975 细胞因存在EGFRT790M/L858R突变而对吉非替尼不敏感，TPL联合吉非替尼增加了耐药细胞的敏感性，提示TPL有逆转吉非替尼耐药的潜力。此外，细胞凋亡和细胞周期检测结果同样显示，TPL联合吉非替尼可明显诱导H1975细胞凋亡并将其阻滞于G0/G1期。这些结果均证实了TPL联合吉非替尼可发挥显著的抗肿瘤作用，能更有效地抑制肿瘤细胞的生长，诱导其凋亡并阻滞细胞周期。

本研究进行的计算机模拟分子对接发现，与EGFR野生型编码产物相比，TPL与EGFRT790M/L858R突变型编码产物的结合更稳定，进一步佐证了TPL 联合吉非替尼的协同抑制作用。有研究表明，TPL 可通过氢键与EGFR 结构域中的ATP 结合，结合自由能为-5.69 kcal/mol，且结合是稳定的[14]。本研究结果与上述研究基本一致，提示化合物的结构特征决定了其与EGFR的亲和力，这可能也是影响联用药物协同效应的重要原因。

由于细胞对药物的敏感性涉及多种因子和途径的复杂交替过程，因此揭示联合靶向治疗的特定分子途径是一项具有挑战性的工作。PI3K/Akt 途径是EGFR 下游的一条重要信号通路，EGFR 磷酸化激活后可形成Shc-Grb2-SOS1 复合物，从而激活PI3K，激活的PI3K 可催化磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸的生成并进一步促进Akt激活，从而抑制肿瘤细胞凋亡并促进其生长[15—16]。本研究结果显示，吉非替尼、TPL 单用和两者联用均可下调PI3K、Akt 蛋白的表达，且两者联用的效果优于吉非替尼、TPL单用。这提示PI3K/Akt通路可能是TPL的潜在作用靶点之一，TPL 联合吉非替尼具有协同增效的效果。

现代医学研究表明，自噬与化疗敏感性的关系较为复杂，其中MAP1LC3A、MAP1LC3B等蛋白是MAP1LC3/LC3 自噬家族成员，可反映细胞的自噬水平[17]。有研究指出，mTOR 通路与自噬有关，抑制mTOR 通路可部分激活细胞自噬[18]；同时，作为PI3K/Akt 通路下游的重要调控因子，mTOR可促使肿瘤细胞对化疗/靶向药物产生耐药性[19]。考虑到诱导自噬与EGFR-TKIs 耐药有关[20]，本研究检测了MAP1LC3A、MAP1LC3B、mTOR 蛋白的表达情况。结果显示，吉非替尼、TPL 单用和两者联用均可显著上调细胞中MAP1LC3A、MAP1LC3B的表达，下调mTOR蛋白的表达，且两者联用的效果优于吉非替尼、TPL 单用。这提示H1975 细胞的自噬得以增多，其对药物的敏感性有所提高；同时，PI3K/Akt/mTOR 通路可能是TPL作用的另一潜在靶点。

综上所述，TPL 联合吉非替尼可对EGFRT790M/L858R 突变NSCLC 细胞产生协同抑制作用，其作用可能与下调PI3K/Akt/mTOR 通路和诱导细胞自噬有关。这一结论为TPL的增效作用提供了潜在的研究方向，但仍需后续动物实验予以验证。