桃核承气汤对慢性肾衰竭大鼠Wnt4/β-catenin信号通路中p-GSK-3β的影响*

朱为坤 张喜奎 林雅银 陈全文 林艳蓝 李灵辉

慢性肾衰竭(Chronic renal failure,CRF)是肾脏及肾脏相关性疾病的最终归宿,相当于慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)的4～5期。肾纤维化(Renal fibrosis,RIF)包括肾小球硬化和肾间质纤维化,是各种肾脏疾病发展至终末期肾衰的共同病理基础和必要环节。对于RIF的治疗,现代医学尚无突破性进展,临床观察发现中医药在改善RIF,延缓CRF方面有一定疗效,其机制值得深入研究。桃核承气汤出自《伤寒杂病论》,具有活血化瘀、通腑泄浊之功,用于治疗瘀热蕴结下焦之证,其病机与RIF相符。本项目以5/6肾切除大鼠CRF模型为载体,通过检测Wnt4、p-GSK-3β、β-catenin等蛋白含量及光镜观察肾组织,研究桃核承气汤对CRF大鼠Wnt4/β-catenin通路中p-GSK-3β的影响,探讨该方改善RIF、延缓CRF的可能机制。

1 材料

1.1 实验动物清洁级雄性 Wistar大鼠100只(上海斯莱克实验动物有限责任公司),7周龄,体质量 180～200 g,饲养于福建中医药大学实验动物中心。

1.2 实验药物注射用青霉素钠,400万IU/支(华北制药股份有限公司);水合氯醛(青岛宇龙海藻有限公司),配成10%浓度[桃核承气汤:福建中医药大学附属第二人民医院提供中药饮片,桃仁12 g,生大黄(后下)12 g,桂枝6 g,炙甘草6 g,芒硝(冲)6 g],煎煮并浓缩为42 g/100 ml的溶液。

1.3 主要试剂Wnt4抗体(北京bioss公司,批号20785R);β-catenin 抗体 (美国ABCAM公司,批号32572);p-GSK-3β抗体(北京bioss公司,批号5368R);β-actin 抗体(武汉proteintech公司,批号66009-1-Ig)。

1.4 主要仪器光学显微镜(德国Leica公司);APC300电泳仪(美国BIO-RAD公司);Bio-rad Trans-Blot 小型转印槽转膜仪(美国BIO-RAD公司);ChemiDocXRS+化学发光成像系统(美国BIO-RAD公司)。

1.5 实验方法

1.5.1 分组与造模100只Wistar大鼠,适应性饲养l周后,随机分为正常组、假手术组、模型组、治疗组,每组25只。参照王瑞强等[1]建模方法,模型组与治疗组均行5/6肾切除手术大鼠麻醉后俯卧位固定在鼠台上,手术切除2/3的左肾组织,术后注射青霉素,连用3 d。1周后进行第2次手术,切除全右肾,同样予青霉素注射3 d。假手术组的手术过程同模型组,但不切除肾组织,仅做双肾被膜剥离。正常组不做任何处理。术后3周,各组大鼠眼底静脉丛采血,检测血清肌酐(Scr)。结果显示,与正常组和假手术组对比,治疗组、模型组的Scr水平明显增高,提示造模成功。

1.5.2 给药干预术后4周每天上午9时给药:治疗组予桃核承气汤4.2 g/kg灌胃,正常组、假手术组、模型组分别予等量生理盐水灌胃,剂量均根据临床上成人每公斤体质量用量的6倍换算而成,给药时间共为8周。每周给大鼠称重1次,并根据最新体质量调整药量。

1.6 标本采集

1.6.1 血液给药后第57天上午,大鼠麻醉后采集腹主动脉血液,用于测定血常规中红细胞(RBC)、血红蛋白(Hb)和肾功能中Scr、尿素氮(BUN)。

1.6.2 肾组织采血后,取出大鼠左肾(模型组和治疗组为左残余肾),一部分行苏木精-伊红(HE)染色,用于光镜观察;另一部分用于检测肾组织Wnt4、p-GSK-3β和β-catenin的蛋白含量。

1.7 检测方法

1.7.1 Western Blot将肾组织剪切成小块装入EP管中加入RIPA裂解液及蛋白酶/磷酸酶抑制剂,研磨组织,收集蛋白上清液,BCA法测定蛋白浓度,100 ℃煮样5 min使蛋白变性。配制10%SDS-PAGE电泳凝胶,加入各组蛋白样品,经电泳分离蛋白后,采用半干式电转仪将目的蛋白转移至PVDF膜上,TBST清洗,室温封闭1 h后加入一抗(Wnt4、β-catenin、p-GSK-3β抗体稀释浓度比例分别为:1∶1000、1∶5000、1∶1000),4 ℃ 摇床孵育过夜。TBST充分洗膜后,加入相应HRP标记的二抗(1∶3000),摇床室温孵育1 h。TBST充分洗膜后,暗室中滴加增强型化学发光剂(ECL发光剂)于膜上,曝光、显影、定影,Quantity One图像分析系统检测各目的蛋白光密度值,以β-actin为内参,对比分析各目的蛋白表达水平。

1.7.2 肾组织观察将大鼠肾组织修剪后脱水,石蜡包埋,而后切成每片厚2 μm的薄片,置于载玻片上,于60 ℃恒温箱烤片1 h,HE染色,中性树胶封片,光镜观察。

1.8 统计方法采用SPSS 26.0软件分析实验数据。计量资料采用均数±标准差表示;各组间比较采用单因素方差分析;如各组间存在差异,则继续组间两两比较,方差齐采用LSD法,方差不齐采用Games-Howell法。从P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况观察正常组和假手术组:精神状态良好,反应灵敏,皮毛有光泽,能正常进食、饮水,二便正常。模型组:精神较为萎靡,反应迟钝,体质量增长缓慢,体毛干枯无光泽且易脱落。治疗组大鼠的各项情况介于正常组和模型组之间。

2.2 各组大鼠存活情况比较各组大鼠在实验过程中,出现不同程度的死亡,模型组死亡数量最多,治疗组次之,正常组死亡最少。主要死亡原因可能是手术过程中麻醉过量、大出血或伤口感染,部分可能因灌胃不当或肾衰竭死亡。见表1。

表1 各组大鼠存活情况比较 (只,%)

2.3 各组大鼠血常规结果RBC计数及Hb含量,与正常比较,假手术组差异无统计学意义(P>0.05);模型组、治疗组显著降低(P<0.05)。RBC计数及Hb含量,治疗组比模型组显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血常规比较 (只,

2.4 各组大鼠肾功能比较血清Scr、BUN含量,与正常比较,假手术组差异无统计学意义(P>0.05);模型组、治疗组显著升高(P<0.05)。血清Scr、BUN含量,治疗组比模型组显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠肾功能比较 (只,

2.5 各组大鼠Western Blot法检测比较Wnt4、p-GSK-3β、β-catenin 蛋白含量,与正常组比较,假手术组差异无统计学意义(P>0.05);模型组、治疗组显著升高(P<0.05)。Wnt4、p-GSK-3β、β-catenin 蛋白含量,治疗组比模型组显著降低(P<0.05)。见图1,表4。

图1 各组大鼠Wnt4 p-GSK-3β β-catenin蛋白表达水平

表4 各组大鼠Wnt4 p-GSK-3β β-catenin蛋白含量比较 (只,

2.6 各组大鼠肾组织比较正常组、假手术组:肾组织形态及结构完整,均未见肾小球、肾小管及间质的病理改变。模型组:肾组织结构紊乱,可见大量炎症细胞浸润,肾小球结构固缩,基膜增厚,肾小管扩张,肾间质纤维增生严重。治疗组:部分肾组织形态结构基本正常,部分出现病理改变,程度介于正常组和模型组之间。见图2。

图2 肾组织HE染色光镜图(400×)

3 讨论

桃核承气汤出自《伤寒杂病论》,其第106条言:“太阳病不解,热结膀胱,其人如狂,血自下,下者愈。其外不解者,尚未可攻,当先解其外,外解已,但少腹急结者,乃可攻之,宜桃核承气汤”。该方主治瘀热结于下焦证,临床上可见少腹疼痛、胀满、拘急、烦躁不安、发狂等证候。桃核承气汤由桃仁、大黄、芒硝、桂枝、炙甘草组成。桃仁苦甘平,活血祛瘀、润肠通便,《神农本草经》谓其可“去瘀血、血闭、癥瘕、邪气”,《本草经疏》言其“性善破血,散而不收,泻而无补”;大黄苦寒,泻下攻积、清热泻火解毒、化瘀止血,《神农本草经》言其可“下瘀血、血闭寒热,破癥瘕积聚,荡涤肠胃,推陈致新……安和五脏”,《药品化义》载:“大黄气味重浊,直降下行,走而不守,有斩关夺门之力……用此开导阳邪,宣通涩滞,奏功独胜”,二者合用,气血通行,使瘀热从下而走,共为君药。芒硝咸苦寒,《珍珠囊》言:“其用有三,去实热……涤肠中宿垢……破坚积热块”,可助大黄泄热通便;桂枝辛甘温,《本经疏证》言:“其能和营、通阳、利水、下气、行水、补中”,可助桃仁活血化瘀、通利血脉,又防大黄、芒硝苦寒太过,二者为臣。炙甘草甘平为佐使,既可调和寒温诸药之用,又能补中护中,防止偏性之品损伤中气。《伤寒来苏集》言:“气留不行,故君大黄之走而不守者,以行其逆气;甘草之甘平者,以调和其正气;血结而不行,故用芒硝之咸以软之,桂枝之辛以散之,桃仁之苦以泄之”。全方共奏活血化瘀,通腑泄浊之功。

肾位于下焦,RIF属于中医“水肿、溺毒”等范畴[2],两者之间具有正相关性[3]。CRF存在高凝状态,与凝血因子水平异常,血管内皮细胞、血小板、抗凝系统等功能异常相关。桃核承气汤中桃仁、大黄、桂枝有活血化瘀、行气通脉的作用,能够改善RIF,延缓CRF。CRF与RIF均存在肾小球滤过率(GFR)下降的病理变化,导致Scr、BUN、胺类、酚类等毒素在体内蓄积,影响全身各系统功能。这些毒素属于中医“浊毒”范畴。桃核承气汤中大黄、芒硝、桃仁均能促进排便,使体内的毒素从大便而出,起到降浊祛毒的功效。临床观察发现,在西医基础治疗的前提下,加用核桃承气汤辅治早中期CRF,比单纯的西医治疗,能更好地改善中医证候积分、肾功能,降低CRP、IL-6、TNF-α、MDA等,升高Ccr、TAC、SOD等,提高临床疗效[4]。桃核承气汤联合中药灌肠,可有效缓解CRF患者临床症状,改善机体营养状况,降低IL-1、IL-6、hs-CRP、TNF-α等炎性因子水平、改善肾功能[5]。

RIF与Wnt/β-catenin信号通路密切相关。β-catenin蛋白可调节细胞增殖、分化和凋亡[6],促进RIF。Wnt蛋白减少时,降解复合物中的GSK-3β将β-catenin磷酸化,使其含量下降,阻止了信号传导;Wnt蛋白增多时,激活GBP蛋白,使其与GSK-3β结合,形成无活性的p-GSK-3β,从而抑制β-catenin的降解,使其含量增多,促进信号通路传导。Wnt4可以激活β-catenin依赖的Wnt信号通路[7],参与RIF进程,且RIF的程度与p-GSK-3β蛋白表达相关[8]。实验研究发现桃核承气汤可改善CRF大鼠肾功能,降低血Scr、BUN,降低肾小球硬化指数,改善RIF,从而延缓CRF的进程[9]。另有研究发现,桃核承气汤对RIF大鼠的保护作用机制可能与抑制肾组织中Wnt/β-catenin和Notch-Hes1信号通路相关[10], 也可能与调节磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶1(PCK1)等蛋白,影响AMPK、Fox O/Wnt、PPAR、HIF-1等信号通路相关[11]。

本团队围绕“桃核承气汤治疗CRF的作用机制”开展了系列研究,发现在以5/6肾切除CRF大鼠模型为载体的实验研究中,桃核承气汤能改善肾微炎症状态,改善RIF,延缓CRF发展进程,其机制可能是上调BMP-7、MMP-2,下调TIMP-2;也可能与调控肾的TGF-β1/Smad信号通路和Wnt/β-catenin信号通路有关[12,13]。但是桃核承气汤对CRF大鼠Wnt4/β-catenin通路中p-GSK-3β是否有影响,尚不明确。通过本研究发现,桃核承气汤对CRF大鼠的影响主要有以下几个方面:①提高RBC计数和Hb含量水平,有效改善贫血;②抑制Scr、BUN的升高,调节肾功能;③抑制Wnt4、p-GSK-3β和β-catenin 蛋白的升高;④肾组织观察,治疗组部分肾组织形态结构基本正常,部分出现病理改变,程度介于正常组和模型组之间,说明在改善RIF,减轻炎症,延缓CRF等方面,桃核承气汤具有一定疗效。由此可以推测,其机制可能是通过抑制Wnt4、p-GSK-3β、β-catenin蛋白来调节Wnt4/β-catenin信号通路。