阿维菌素废菌渣循环利用的发酵工艺研究

刘丽虹，程曦，杨柳，张伟龙，夏冰，寇娜

(1.石家庄市农业技术推广中心，石家庄 050000; 2.河北兴柏农业科技股份有限公司河北省阿维菌素生物技术重点实验室，石家庄 051530)

阿维菌素是阿维链霉菌深层发酵而得的高效低毒生物农药和医药中间体，在农业、畜牧业和医药领域都有广泛的应用[1]。21 世纪，随着基因编辑、合成生物学等现代前沿生物技术在微生物育种上的应用，构建出主产阿维菌素B1a 工程菌的产业化，阿维菌素放罐效价达7～8 g/L[2-3]，同时大量发酵效价增长的统计数据显示，发酵培养的前4 d，日平均效价增长量仅为其后的1/2。这是由于阿维链霉菌菌体生长与产物合成非偶联，其发酵培养经过生长繁殖期、稳定期和产素期，由于稳定期的存在，阿维菌素生物合成所需的各种前体物质和酶的积累有个过程，对前期效价增长有一定程度的影响。为此，业界开展了前体物质对效价影响的研究，来缩短稳定期，提高发酵效价。陈海燕等[4]研究了在发酵培养过程中滴加丙酸钠、乙酸钠对效价的影响。王文亮等[5]研究了在培养基中添加缬氨酸、亮氨酸作为前体物质对效价增长的影响。程曦等[6]研究了在发酵前期补入产素期发酵液，诱导处于生长繁殖期的阿维链霉菌生物合成阿维菌素。阿维菌素生物合成本质是阿维链霉菌进行复杂的生物化学反应过程，其生化反应总速度由相对较慢的步骤决定，添加一种或几种前体物质难以保证生化反应速度的整体提高，尝试开展在阿维菌素发酵培养基中添加阿维菌素废菌渣作为前体混合物的工艺研究，在回收利用废菌渣的同时，提高阿维菌素发酵效价。

阿维菌素废菌渣是阿维菌素发酵液经过滤、烘干、萃取、干燥后的固体物质(以下通称菌渣)，主要成分为阿维链霉菌菌丝体、助滤剂及其初级代谢产物，阿维菌素B1a 含量仅为0.1%～0.2%。生态环境部出台的《国家危险废物名录(2021 年版)》规定，将抗生素菌渣按照危险废物处置和管理，限制其作为肥料和饲料的应用。当前主要的处置方式为焚烧[7]，既增加碳排放、浪费能源和资源,又有悖于绿色低碳发展的理念。而生态环境部出台的《制药工业污染防治技术政策》鼓励企业研究、开发、推广发酵菌渣在生产工艺中的再利用技术。笔者就此在摇瓶及50 L 发酵罐上研究了培养基中添加菌渣对发酵效价及培养过程的影响，为循环利用菌渣和进一步提高发酵效价提供思路、方法和相关数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)AVX-33由河北兴柏农业科技股份有限公司菌种室提供。

1.1.2 设备

20 L 种子罐、50 L 发酵罐，配套有补料、DO和pH 等自动控制系统和具有数据采集及分析功能的软件系统(镇江东方生物工程设备技术公司)；NDJ-1 型旋转式黏度计(上海越平科学仪器有限公司)；TS-211B 卧式恒温摇床(无锡玛瑞特科技有限公司)；Agilent 1260 高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)。

1.1.3 菌渣

来源于本公司提取车间(F622-20221127)，黑褐色粉末或颗粒状，过40 目筛筛选。主要成分为粗蛋白、粗纤维和无氮浸出物(表1)及17 种氨基酸，其中谷氨酸1.61%、亮氨酸1.32%、甘氨酸1.22%、丙氨酸1.06%、脯氨酸1.03%、天门冬氨酸0.94%、缬氨酸0.90%等，含量最低的蛋氨酸0.050%。

表1 菌渣主要成分及含量 (%)

1.2 培养基及培养条件

1.2.1 摇瓶种子培养基

质量浓度分别为玉米淀粉25 g/L，热轧黄豆饼粉8 g/L，花生饼粉10 g/L，酵母膏4 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钴10 mg/L，消前pH 8.0～8.5。

培养条件：摇床转速220 r/min，温度28～29 ℃，培养时间2～3 d。

1.2.2 摇瓶发酵培养基

质量浓度分别为淀粉140g/L，热轧黄豆饼粉21g/L，酵母粉8 g/L，菌渣8 g/L，轻质碳酸钙1.6 g/L，淀粉酶质量分数0.025%；消前pH 7.5～8.0，摇瓶装量50 mL/250mL，接种量5 mL。

培养条件：温度27～28 ℃，转速220 r/min，培养时间10～12 d。

1.2.3 种子罐(20 L)

原材料质量浓度分别为淀粉22 g/L，热轧黄豆饼粉6 g/L，酵母粉3g/L，花生粉6 g/L，酵母膏3 g/L，氯化钴10 mg/L；计料体积12 L，消前pH 9.0～9.5、消后pH 7.3～7.8。

培养条件：温度28～29 ℃，空气流量10～25 L/min，搅拌转速200～600 r/min，培养时间2～3 d。

1.2.4 发酵罐(50 L)

按接后体积计算投料量，原材料质量浓度分别为淀粉140 g/L，热轧黄豆饼粉21 g/L，酵母粉8 g/L，菌渣8 g/L，轻质碳酸钙1.6 g/L，淀粉酶质量分数0.025%；消后体积33～35 L，接种量8%～10%。

培养条件：温度27～28 ℃，搅拌转速600 r/min，空气流量30～45 L/min，培养时间10～12 d。

1.3 测定方法

1.3.1 黏度测定

取发酵液适量，选2#转子，将黏度计的转子没于发酵液中，并使液面淹没于转子的凹槽刻度处，开启黏度计，旋转稳定后读取黏度值。

1.3.2 生物量测定

准确量取50 mL 发酵液置于250 mL 三角瓶中，添加适量助滤剂。于水浴锅中升温至约95 ℃，维持3～5 min，抽滤得滤饼，适量热水洗，102 ℃烘干至恒重，降温称量(W2)，计算生物量。

式中：20 为换算系数，W1为助滤剂质量，W0为滤布质量。

1.3.3 B1a 效价测定

精确称取2 mL 发酵液，加入50 mL 容量瓶中，再添加适量甲醇至规定位置，超声浸取10～20 min，甲醇定容、过滤待用。

HPLC 系统：色谱柱C18、4.6 mm×250 mm，柱温30 ℃，流动相甲醇∶水=9∶1 (体积比)，流量1.0 mL/min、测量用波长246 nm，进样量20 μL，记录测量的峰面积，外标法计算B1a 效价。

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度菌渣对效价的影响

为考察菌渣对发酵效价的影响情况，对其设计了5 个质量浓度：4、6、8、10、12 g/L。其中，每个质量浓度接3 支三角瓶进行摇瓶试验，图1 数据(平均值±标准差)显示，随着菌渣质量浓度的增加，放瓶效价逐渐提高，当菌渣质量浓度达8 g/L时，放瓶效价最高，达到8 053µg/mL，这是由于培养基中添加菌渣后，等效于发酵液中提前积累了阿维链霉菌的初级代谢产物，缩短了稳定期，相对延长了产素期，提高放瓶效价。而后又逐步下降，当菌渣质量浓度增至12 g/L，放瓶效价下降至7 432µg/mL，是由于菌渣中存在的某些限制性物质过量，抑制了阿维菌素的生物合成。故以菌渣质量浓度8 g/L，在50 L 发酵罐研究其对发酵效价、生物量和黏度等指标的影响情况。

图1 菌渣质量浓度对效价的影响

2.2 菌渣对发酵效价的影响

将培养好的种子液按10%接种量分别转入相同培养条件的试验组和对照组。图2 为11 批次起步效价对比数据，培养基添加菌渣罐批平均起步效价(平均值±标准差)(479±81)µg/mL，较对照组(385±82)µg/mL 高94 µg/mL，增加24.0%，有显著提高(P单尾=0.007)。抗生素作为次级代谢产物，是由于初级代谢产物的过量积累和外界环境胁迫所产生的有利于其生产的代谢活动[8]，在阿维菌素发酵培养基中加入适量菌渣相当于提前积累了阿维链霉菌的初级代谢产物和添加合成阿维菌素所需的前体物质，有利于初级代谢向次级代谢的转化，缩短稳定期，提高发酵起步效价。图3 为11 批次放罐效价对比数据，试验组平均放罐效价(平均值±标准差)(8 042±716)µg/mL，较对照组(7 366±563)µg/mL 高676µg/mL，增加9.0%，有显著提高(P单尾=0.011)。这是由于试验组添加菌渣后，有利于初级代谢向次级代谢的转化，缩短了稳定期，相对延长了产素期，即增加了阿维链霉菌生物合成阿维菌素的时间，提高了放罐效价；试验组标准差716µg/mL，较对照组563 µg/mL 高153µg/mL，无显著差异(P=0.46)。

图2 菌渣对起步效价的影响

图3 菌渣对放罐效价的影响

2.3 菌渣对生物量、黏度的影响

生物量表示单位体积发酵液中菌丝体的数量，与其他理化指标一样对发酵效价有重要影响，其浓度大小与培养基特别是其中氮源含量密切相关[9]。将培养好的种子液依次接入试验罐和对照罐，29 h开始取样检测试验罐和对照罐的生物量(图4)。结果表明：29 h 生物量分别快速达到36.3、28.8 g/L，这期间主要表现为阿维链霉菌的生长繁殖期，随后生物量的增加相对较慢，增加机理主要表现为发酵液的蒸发作用，至281 h 放罐生物量分别为52.8、42.3 g/L，且全程表现为试验罐生物量高于对照罐，原因在于试验罐培养基加入了8 g/L 的菌渣。但在发酵培养的后期增加的更多，是由于随着发酵的进行，阿维链霉菌自身产生了某些蛋白酶，酶解并利用菌渣中的粗蛋白引起一定程度的二次生长繁殖，但此时的阿维链霉菌已经具有次级代谢能力，表现出菌体生长繁殖与产物合成同时进行的混合型发酵特征，所以并未对效价增长造成影响。此现象有别于传统的阿维链霉菌菌体生长与产物合成非偶联特征。

图4 菌渣对生物量的影响

黏度作为发酵控制的重要指标，对发酵液中氧的传递有重大影响。其高低除了与生物量有关外，还与菌丝形态、代谢过程密切相关。图5 表明：发酵培养29、41 h 试验罐生物量明显高于对照罐，但黏度(69.6、74.2 mPa·s)与对照罐(71.4、73.8 mPa·s)相当，这是由于试验罐生物量高，与加入了质量浓度8 g/L菌渣有关。但随着发酵培养的深度进行，发酵后期试验罐(88.4 mPa·s)黏度明显高于对照罐(81.7 mPa·s)，这是由于发酵后期，试验罐菌渣中粗蛋白的酶解导致菌体二次生长繁殖，菌体细胞原生质饱满，菌丝刚性增加所致[10]，且以后的多次试验，重复了这一现象。

图5 菌渣对黏度的影响

3 结论

长期以来，抗生素菌渣的处置技术限于政策困境，一方面严格限制其作为肥料、饲料的使用，而采取焚烧的处置方式，又有悖于低碳经济和科学发展观，使菌渣的处置进入两难境地。开展菌渣无害化处理或循环利用菌渣的研究成为必然，以消除或减轻菌渣对环境污染的影响。张广志等[11]在菌渣中分离出嗜热脂肪芽孢杆菌，并进行堆料发酵，以降解其中的阿维菌素，减轻菌渣中残留阿维菌素对环境影响。刘小鹏等[12]研究了阿维菌素菌渣经微生物发酵改性后替代其他氮源在阿维菌素发酵培养中的应用技术，以降低阿维菌素生产费用。由于阿维菌素是阿维链霉菌生长繁殖到一定阶段开始生物合成，本研究基于菌渣混合物的初级代谢产物特性，加入培养基后，等效于提前积累初级代谢产物和合成阿维菌素所需的基质、前体和诱导物，有利于加快初级代谢向次级代谢的转化进程，提高起步效价；缩短稳定期，即相对延长产素期，提高放罐效价。

研究结果表明：在培养基中添加8 g/L 菌渣，能够加快阿维链霉菌由初级代谢向次级代谢的转化进程，缩短阿维菌素发酵培养的稳定期，提高发酵效价。其中，阿维菌素发酵起步效价增加24.0%、放罐效价增加9.0%，为进一步工业化应用提供数据和理论支撑。同时，该研究对其他菌体生长繁殖与产物合成非偶联型次级代谢发酵菌渣的再利用有借鉴价值。