灰霉病处理红颜草莓果实后相关抗病转录因子的表达量分析

杨戎戈李梓薇黄林源王晶晶赵林林尹景伟羊晔王静文张艳

(1.江苏省水文水资源勘测局扬州分局，江苏 扬州 225000；2.扬州大学/江苏省作物遗传生理重点实验室/江苏省作物栽培生理重点实验室/江苏省粮食作物现代产业技术协同创新中心，江苏 扬州 225009；3.扬州文水科技咨询有限公司，江苏 扬州 225000)

引言

草莓为蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragaria)多年生常绿草本植物，草莓因外观美观，口感鲜嫩多汁，有“水果皇后”“水果牛奶”之美誉[1]，其含有丰富的蛋白质、维生素B1、维生素B2、维生素C，每100g新鲜果实里约含有60mg维生素C，以及有机酸如水杨酸、柠檬酸。草莓还含有草莓胺，具有很好的药用价值。中国的草莓野生资源丰富程度世界排行第1，生产面积最大[2]。本试验选用“红颜”草莓品种，由日本引进，果实形状为长圆锥形，此品种休眠浅，产量相对较大。

灰霉病是草莓生长成熟及采收贮藏中极易发生病害之一。草莓灰霉病是由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea.)引起的病害，主要为害草莓叶片、茎、花以及果实部分，也对年产量和草莓的外观品质影响严重[3]。灰葡萄孢菌具有生长繁殖迅速，易抗药，在0℃以下依然繁殖的特点[4，5]。本试验过程中，感染灰霉病的草莓果实果肉变软逐渐腐烂，果实表面生出灰褐色霉状斑点，未成熟的果实病变时，草莓果实会显现出淡褐色干枯病斑，转至呈干腐状[6]。草莓生产过程中，此病菌普遍发生于果实转色期到果实成熟期，12个月可危害30%～80%，病情逐渐严重[7]，后期为害严重会导致草莓减产10%～50%[6-8]。此病菌不经控制会对草莓栽培造成极大的经济损失。

本试验分析旨在于防治灰霉病的方法，筛选优良抗病的草莓品种，为未来抗病基因研究铺设道路。

1 材料和方法

1.1 试验材料

草莓的品种丰富，本试验挑选八倍体草莓品种“红颜”(Fragaria×ananassa Duch.‘Benihoppe’)作为试验材料。2016年11月27日—12月24日，于江苏农林职业技术学院北校区连栋温室大棚内进行试验，大棚内白天温度在13～21℃，夜间温度在9～15℃。此期间，草莓生长状态良好，无病虫危害。

灰霉菌的培养方法：所用灰霉菌(Botrytis cinerea)由江苏农林职业技术学院农学园艺系试验田所得。使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)为病菌培养基。

在PDA培养基上接种用常规方法纯化后的灰霉菌，放入恒温箱培养14d(25℃)。处理果实，应将培养基在超净工作台上切下并放入装有至少100mL无菌水的锥形瓶中，打开2个灰霉病培养基，将锥形瓶中的无菌水分别均匀倒入2个培养基中。用玻璃棒轻轻刮蹭培养基表面的灰霉菌核。将菌液倒入锥形瓶中。将培养基戳碎，倒入锥形瓶中。用干净的塑料纸封住瓶口，皮筋扣住。将菌液放在震荡器摇床上震荡10min。用4层纱布过滤，显微镜镜检调整，制备悬浮液(孢子悬浮浓度为1×105cfu·mL-1)，用于接种果实。

1.2 试验方法

1.2.1 灰霉菌处理对不同发育时期草莓果实的影响

2016年12月26日于植物组织培养母液配制室内做试验，每组分别有红、白、青3种颜色的草莓。器材：纸，玻璃瓶或培养皿，针，酒精灯，菌液(灰霉病)，刷子，喷壶。在每个玻璃瓶底部垫上大小合适的纸，用喷壶将纸喷湿，不要过湿。将针在酒精灯上灭菌后，在每个草莓的不同部位上戳2个洞(不用刺穿)。此时选用不同发育时期的草莓果实，果实表皮颜色分别红、白、青3种。每个草莓戳洞后刷上灰霉病菌液，放入玻璃瓶中。做完4组后，加1组没有刷菌液与戳洞的对照实验。每组草莓中各有1个红、白、青草莓果实。放置在植物组织培养母液配制室内，每天观察是否发病，相同时间段刷一次菌液，等待发病取照。

2016年12月31日发现草莓发病，给草莓拍照，照片清晰，分组明确。在凝胶成像系统实验室内进行试验。佩戴好一次性手套，用小刀将草莓表面的籽粒和表皮仔细清除，剪裁大小正好的锡纸，将去了籽粒的草莓用刀片切成薄片状，用锡纸把草莓薄片包裹好。倒出部分液氮在泡沫盒内，把锡纸包裹的草莓切片放入液氮(1个草莓用1个锡纸包裹，完成后立即放入液氮)。标好姓名、组数、班级。从液氮中取出草莓锡纸，放入塑料袋中，放进超低温冰箱。

1.2.2 草莓果实RNA的提取

洗刷研钵研杵后放入灭菌锅灭菌2h，在研钵中倒入适量液氮进行预冷，从-80℃冰箱中取出植物组织样品，在确保样品不潮湿的状态下，把其加入预冷好的研钵中研磨，考虑到不彻底的研磨会影响RNA的质量和收率，应该把组织样品研磨至无明显可见颗粒的粉末状(期间应持续加入液氮)。取出1.5mL的灭菌小管子，加入450μL的Buffer PE，再往其中加入20～50mg研磨后的粉末状样品。为更好地裂解液中无明显沉淀，可使用移液器反复吹打。

将上述裂解液置入离心机，12000rpm，4℃离心8min。

新取1个1.5mL灭菌小管子，用移液枪提取350μL上清液，小心加入其中。加入体积为上清液1/10(35μL)的Buffer NB，Vortex震荡摇匀。

将所得液体置入离心机，低温离心，12000rpm，4℃离心5min，以下离心机均设为4℃。

将上清液吸取至新的1.5mL灭菌小管子中，此时枪量程为300μL。加入450μL的Buffer RL(使用前请确认已加入50倍DTT Solution)，使用移液枪将溶液吹打混匀。

按照“Total RNA的提取”流程进行以下步骤。

加入375μL C2H5OH，得到1125μL混合液。出现沉淀时使用移液枪将溶液吹打混匀。

第1次用移液枪吸600μL转入柱子，离心1min，12000rpm。弃滤液。第2次将剩余525μL混合液转入柱子中，离心1min，12000rpm。弃滤液。

在柱子中加入500μL 的Buffer RWA，12000rpm，离心1min，弃滤液。

在柱子中加入600μL的Buffer RWB，12000rpm，离心1min，弃滤液。(确认Buffer RWB中已经加入了指定体积的100%乙醇)沿柱子管壁四周加入Buffer RWB，有助于冲洗粘附在壁管上的盐分。

(1)管，将配制好的酶液加入50μL至柱子中，此时枪头一定要伸到柱子中间，放置15min。(2)管，向柱子中央加入500μL的Buffer RWB，尽量在边上绕一圈，离心1min，12000rpm，弃滤液。

在柱子中加入600μL的Buffer RWB，12000 rpm，离心1min，弃滤液。(确认Buffer RWB中已经加入了指定体积的100%乙醇)沿柱子管壁四周加入Buffer RWB，有助于冲洗粘附在壁管上的盐分。

将滤液倒掉，再将管子空转1min。换管子，留中柱。将RNase Free dH2O放在金属浴上设置60℃，预热5min。此时将盖子打开挥发酒精。每个中央加入50μL的RNase FreedH2O。加入后放置1～2min，离心2min，12000rpm，此时有2个盖子，扔掉中柱，保留小管子。

配胶：往锥形瓶倒入40mL 1倍的TAE，称取0.40g琼脂，将二者混合均匀。用微波炉加热1～2min，直至药品呈透明状。向锥形瓶中加入1滴Eb，混合均匀。准备做1块中等大小的胶。使用中梳，将小管子里的RNA用loading Buffer标记，依次注入胶孔以及5μL的marker。跑胶时间大致为30min。

1.2.3 灰霉菌处理对草莓果实中转录因子的影响

表1 灰霉病处理草莓果实后相关抗病转录因子的表达量分析

2017年4月24日在凝胶成像系统实验室，(1)管8μL打到每个小管子里，放小离心机上离心。每个吸取2μL上次试验的RNA打到管底。将每个小管子置于金属浴显示65℃，预热5min。小管子插到制冰机上，4～5min直至冷却。将(2)管加入至小管子，每个为10μL(移液速度要快，加在管壁上)，放在小离心机上离心。如果放置时间长，应储存在冰上。第2天，用移液枪加23μL PCR mix进入每个小管子，将每个草莓的cDNA吸2μL分别加入小管子。放置在小离心机上离心。放置在PCR仪上进行PCR检测。此时做胶，用大梳(孔数要够)将每个小管子的25μL溶液全部点进去，此时不需用loading Buffer标记。点入marker 5μL。

2 结果与分析

2.1 灰霉菌处理对不同发育时期草莓果实的影响

2016年12月26日将草莓刺伤并接种灰霉菌，同年12月31日肉眼观察部分草莓病变。从试验结果分析，不同发育阶段的草莓果实对灰霉病表现出不同程度的病变，5d时间中未用病菌处理的草莓对照组肉眼观察暂未发病，见图1。本试验过程中即将成熟的草莓果实最先病变，表明灰霉病主要危害果实，在即将成熟的果实上最易发病[1]。

图1 草莓果实经过5d灰霉菌液处理

2.2 草莓果实RNA的提取

利用Protocl-I流程从100mg的草莓果实中提取RNA，从图2可知，得到了浓度高低将近相同的RNA。

泳道1：绿果；泳道2：绿果对照；泳道3：白果；泳道4：白果对照；泳道5：红果；泳道6：红果对照；泳道7：marker

2.3 灰霉菌处理对草莓果实中转录因子表达量的影响

从图3可知，图片亮度大致相同，使用PCR技术扩增得到的内参基因，此为得到的RNA浓度基本相同，可以进行以下试验，见图4。

泳道1：绿果；泳道2：绿果对照；泳道3：白果；泳道4：白果对照；泳道5：红果；泳道6：红果对照；泳道7：marker

图4 抗病相关转录因子基因相对表达量

3 讨论

栽培作物的过程中，会有多种多样的病菌微生物侵害植物，本试验主要分析灰霉病处理草莓果实后相关抗病转录因子的表达量。试验分析结果发现，不同发育阶段的草莓果实灰霉病发病时间和发病状态不同。4个抗病相关转录因子WRKY1、WRKY70、ERF3以及NAC1在受到灰霉病侵染后，基因表达量均有不同程度上调。本试验过程中，PCR扩增得到的RNA量大致相等，试验较为顺利。现今已有大量关于草莓灰霉病的分子实验，Rigotti等[9]对灰霉病菌处理过的草莓进行了分子实验[10]。本试验材料为八倍体“红颜”品种，查阅草莓灰霉病相关抗病转录因子文献，了解到这方面的研究相对二倍体草莓较少，因此将继续在分析基因表达的研究上，对草莓灰霉病的相关抗病转录因子进行更深层次的试验分析。