糖皮质激素通过Nrf2/HO-1信号通路对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺氧化应激反应的影响

齐见旭 欧宗兴 李英 王心晓

(海口市人民医院 1呼吸与危重症医学科,海南 海口 570208;2重症医学科)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种常见的进行性发展呼吸系统非传染性疾病,特点是呼吸气流受限、肺部出现慢性炎症,临床表现有咳嗽、气短、呼吸困难等〔1〕。至2020年,COPD居于我国死亡原因第3位,全球死亡原因第4位,且患病率仍在持续上升〔2〕。COPD的发病率、致残率和死亡率都很高,且容易复发。COPD的病因尚不明确,目前已知的高危致病因素有吸烟、空气污染、长期暴露于可吸入颗粒物环境下、呼吸道感染、家族病史等〔3～6〕,这些也是常见的对肺功能造成负面影响的因素。研究〔7〕表明COPD患者患病初期气道和肺组织就已出现炎症。中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等与炎症相关的细胞受到外界或内部条件影响释放出炎症因子,激活多种细胞信号通路,损伤肺部细胞,破坏肺结构〔8〕。临床常用糖皮质激素对COPD患者进行治疗,可有效减轻COPD患者的炎症反应,能够调节机体的代谢和免疫系统,还能影响血液系统及神经系统〔9〕。因其药理作用繁多,糖皮质激素在机体内的具体作用机制还未被研究透彻。核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1(Nrf2/HO-1)信号通路具有保护线粒体、抗炎、抗氧化、调节细胞凋亡等作用〔10〕,可能参与了糖皮质激素调节机体的作用过程。本研究通过检测COPD模型大鼠机体内Nrf2/HO-1通路相关指标水平变化与表达情况探究糖皮质激素对COPD氧化应激反应的影响。

1 材料和方法

1.1实验动物 48只雄性SD大鼠,体质量200～230 g,购自陕西省医学实验动物中心,动物合格证号为SCXK(陕)2018-0009。大鼠自由进食饮水,在23～26 ℃、湿度30%～50%环境下适应性饲养1 w后开展实验。本实验按照动物实验伦理指导守则进行操作。

1.2试剂 香烟(中华牌,焦油量10 mg,尼古丁含量0.9 mg,一氧化碳含量10 mg),脂多糖(货号SMB00704,美国Sigma公司),吸入用布地奈德混悬液(普米克令舒,国药准字H20140475,AstraZeneca Pty Ltd),苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(货号C0105S)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(货号P0012,上海碧云天生物技术有限公司),Masson三色法染色试剂盒(货号M029,上海歌凡生物科技有限公司),大鼠C-反应蛋白(CRP)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒(货号GV-E13446,上海极威生物科技有限公司),大鼠白细胞介素(IL)-6(货号ml064292)、IL-8(货号ml002885)、大鼠肿瘤坏死因子(TNF)-α(货号ml002859)ELISA检测试剂盒(上海酶联生物公司),降钙素原(PCT)ELISA检测试剂盒(货号H151-1)、总超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(货号A001-3-2)、过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒(货号A007-1-1)、丙二醛(MDA)测定试剂盒(货号A003-1-2,南京建成生物工程研究所),兔Nrf2抗体(货号12721)、兔HO-1抗体(货号86806,美国Cell Signaling Technology公司),小鼠β-actin抗体、兔二抗抗体、小鼠二抗抗体、化学发光液(ECL,美国Thermo Fisher公司),其他试剂均为市售分析纯。

1.3仪器 动物烟熏箱、FM系统动物肺功能检测仪(上海玉研科学仪器有限公司),BRM-085Ⅱ型压缩雾化吸入机(百瑞医疗科技有限公司),光学显微镜(德国Leica公司),DNP-9272 电热恒温培养箱(上海甘易仪器设备有限公司),HBS-1096C 酶标分析仪(南京德铁实验设备有限公司),AU480全自动生化分析仪(美国贝克曼库尔特有限公司),LF-Mini4型小型垂直电泳槽(北京龙方科技有限公司),eBlotTML1快速湿转仪(南京金斯瑞生物科技有限公司),TS-2000型脱色摇床(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司),接触式无损定量成像仪(上海易孛特光电技术有限公司)。

1.4分组与造模 将大鼠随机分为对照组、模型组、糖皮质激素低剂量组和糖皮质激素高剂量组,每组12只。采用烟熏联合气管滴注脂多糖的方法建立COPD模型。对照组正常呼吸洁净空气,建模大鼠除滴注脂多糖当天不进行烟熏,之后每日在烟熏箱内接受内置10支烟、为期30 min的烟熏,总共烟熏35 d。第1、14、28天麻醉全部大鼠,建模大鼠经气道滴注浓度为1 mg/ml的200 μl脂多糖,对照组经气道滴注200 μl的生理盐水。36 d使用动物肺功能检测仪检测各组大鼠1 s用力呼吸容积(FEV1)和用力肺活量(FVC)的值,并计算FEV1和FVC的比值,FEV1/FVC<0.7提示造模成功〔11〕。造模成功后开始让糖皮质激素低、高剂量组每日吸入布地奈德气雾剂,剂量分别为0.5 mg和2 mg,吸入时长15 min,对照组与模型组每日吸入雾化的生理盐水,吸入时长与糖皮质激素低、高剂量组相同,持续2 w。

1.5大鼠肺功能检测 给药结束后再次检测各组FEV1和FVC的值,并计算FEV1和FVC的比值。

1.6HE染色观察肺组织形态 处死大鼠后取出两肺,取部分肺组织用生理盐水冲洗干净,放入4%多聚甲醛中固定,经脱水后石蜡包埋,制成4 μm厚的石蜡切片。按照HE染色试剂盒说明书的要求进行HE染色,在光镜下观察各组大鼠肺组织形态。

1.7血清中炎性因子水平检测 分离大鼠腹主动脉,采集动脉血并按照ELISA检测试剂盒说明书的要求进行样本前处理与实验操作,检测大鼠动脉血血清中CRP、PCT、IL-6、IL-8、TNF-α水平。

1.8血清中氧化应激指标检测 按照生化检测试剂盒说明书的要求进行样本前处理与实验操作,检测大鼠动脉血血清中SOD、CAT、MDA水平。

1.9Masson法检测大鼠肺组织纤维化程度 取石蜡切片,按照Masson三色法染色试剂盒说明书的要求进行Masson染色,在光镜下观察并拍摄各组肺组织纤维化结果,用ImageJ软件计算Masson染色中蓝色胶原纤维面积的百分比。

1.10Western印迹检测肺组织中Nrf2、HO-1表达 取肺组织制成匀浆,加入适量的预冷蛋白裂解液,充分混合后置入冰盒内低温孵育2 h。裂解完成后将匀浆放入低温离心机内,在4 ℃、10 000 r/min条件下离心10 min,取上清液进行BCA定量,制成总蛋白含量相同的Western印迹上样。凝胶电泳分离样品蛋白,转膜,截取目的条带,浸于5%脱脂奶粉制成的封闭液中,放到摇床上室温封闭1 h。加入1∶500稀释的一抗孵育液,充分摇匀后于4 ℃环境下过夜。平衡至室温后洗膜,加入1∶5 000稀释的对应二抗孵育液,室温孵育2 h,洗膜后加入ECL,避光反应5 min,用定量成像仪收集结果。

1.11统计学方法 采用SPSS19.0软件进行t检验,方差分析。

2 结 果

2.1各组外观变化与肺功能检测结果 对照组大鼠外观与实验前无明显变化,呼吸正常,口鼻无明显分泌物。模型组毛色泛黄无光泽,出现咳嗽的情况,口鼻有浓稠分泌物。糖皮质激素低、高剂量组较模型组情况有所改善,毛色较为正常,咳嗽症状减轻,口鼻分泌物减少。肺功能检测结果显示,与对照组相比,模型组、糖皮质激素低、高剂量组肺功能指标均明显下降(P<0.05);与模型组相比,糖皮质激素低、高剂量组肺功能指标均明显上升(P<0.05)。见表1。

表1 各组肺功能检测结果

2.2各组肺组织HE染色结果 与对照组相比,模型组肺泡、肺泡管、肺泡囊出现膨胀融合现象,管腔内存在黏液与炎性细胞;与模型组相比,糖皮质激素低、高剂量组肺组织结构更完整,管腔内黏液与炎性细胞相对减少。见图1。

图1 各组肺组织(HE染色,×400)

2.3血清中CRP、PCT、IL-6、IL-8、TNF-α、SOD、CAT、MDA水平比较 与对照组相比,模型组、糖皮质激素低、高剂量组CRP、PCT、IL-6、IL-8、TNF-α、MDA水平均明显上升,SOD、CAT水平明显下降(P<0.05);与模型组相比,糖皮质激素低、高剂量组CRP、PCT、IL-6、IL-8、TNF-α、MDA水平均明显下降,SOD、CAT水平明显上升(P<0.05)。见表2。

表2 各组血清CRP、PCT、IL-6、IL-8、TNF-α、SOD、CAT、MDA水平比较

2.4各组肺组织纤维化程度 与对照组相比,模型组、糖皮质激素低、高剂量组肺组织结构出现变化,纤维化程度明显提高,胶原纤维面积明显增大(P<0.05);与模型组相比,糖皮质激素低、高剂量组肺组织结构更完好,纤维化程度降低,胶原纤维面积明显减小(P<0.05)。见图2、表3。

图2 各组肺组织(Masson染色,×200)

表3 各组肺组织胶原纤维面积、Nrf2、HO-1表达水平比较

2.5肺组织中Nrf2、HO-1表达情况 与对照组相比,模型组、糖皮质激素低、高剂量组Nrf2、HO-1表达量均明显上升(P<0.05);与模型组相比,糖皮质激素低、高剂量组Nrf2、HO-1表达量均明显上升(P<0.05)。见表3、图3。

图3 Western印迹检测各组肺组织中Nrf2、HO-1表达

3 讨 论

COPD的主要发病机制为肺部结构的慢性炎症反应与氧化应激〔12〕。患者体内的中性粒细胞与巨噬细胞被外界刺激或内部条件激活并聚集于肺部,令肺部细胞的蛋白降解,破坏肺部组织结构。嗜酸性粒细胞会释放出细胞毒性物质溶解肺泡上皮细胞,进一步加强炎症反应,扩大肺部组织损伤〔13〕。巨噬细胞释放的TNF-α等细胞因子还会激活肺成纤维细胞,使其增殖,合成大量胶原并积聚细胞外基质,导致肺部组织纤维化〔14〕。肺部损伤令肺功能降低,FEV1/FVC<0.7是临床上诊断COPD的指标之一。本研究说明,糖皮质激素能够在一定程度上抑制炎症相关细胞的激活,减轻机体内的炎症反应与氧化应激。

CRP是一种急性时相反应蛋白,会对IL-6的水平变化作出反应,作为血液炎症标志物应用于临床诊断当中〔15〕。PCT能够反映机体全局炎症反应的活跃程度,预测COPD患者的死亡率〔16〕。IL-6与IL-8能够激活中性粒细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞,TNF-α会进一步提高IL-8的水平〔17〕。本研究说明,糖皮质激素抑制了COPD大鼠机体内炎性细胞因子的水平。

正常机体内氧化物与抗氧化物处在动态平衡的状态中〔18〕,若机体摄入外源性氧化物,如香烟的烟雾和可吸入颗粒物,就会消耗体内的抗氧化物,影响原本的平衡状态。进入肺部的外源性氧化物可以直接伤害肺组织和气道,还能够通过多种途径刺激肺部产生炎症反应,释放内源性氧化物,加剧氧化应激反应与氧化物-抗氧化物失衡〔19〕。SOD能够消除代谢过程中产生的自由基,CAT负责促进具有氧化剂毒性的过氧化氢分解,二者都属于抗氧化物〔20〕。MDA是脂质过氧化产物的一种,本研究结果说明,糖皮质激素能够纠正COPD大鼠机体内氧化物-抗氧化物的失衡状态。

Nrf2/HO-1信号通路具有抵抗氧化应激损伤,保护组织脏器的能力〔10〕。Nrf2通过位移至细胞核中与抗氧化反应元件(ARE)结合,激活SOD、CAT及Ⅱ相解毒酶等靶基因,提高抗氧化物表达水平〔21〕。HO-1是Ⅱ相解毒酶的一种,由它引发的下级信号通路具有抗氧化作用〔10〕,HO-1的代谢产物还具有抗炎的作用〔22〕。本研究结果说明,糖皮质激素能起到激活Nrf2/HO-1信号通路的作用。