Wnt细胞信号转导通路在糖尿病足形成过程中的调节机制

杨陆涛 张友来 陈秋莹 曹青

(1九江市第一人民医院烧伤外科,江西 九江 332000;2南昌大学第一附属医院烧伤及创面修复中心)

糖尿病足是糖尿病患者由于下肢远端神经异常和血管病变导致的,患者的临床症状为足部感染、溃疡、足趾畸形等,若不及时治疗,可能导致糖尿病患者截肢和死亡〔1〕。糖尿病足目前临床上尚未有准确的发病机制,有研究认为其与修复细胞、炎性细胞及细胞因子等参与的多重反应有关〔2〕。Wnt细胞信号转导通路能够有效促进上皮重塑及创面血管新生,与糖尿病足的形成关系密切〔3〕。Wnt/β-连环蛋白(catenin)是Wnt细胞通路中典型通路,Wnt/β-catenin细胞信号转导通路与糖尿病大鼠难愈创面有关〔4〕。本研究旨在探讨Wnt细胞信号转导蛋白在不同Wagner分级糖尿病足患者形成过程中的调节机制。

1 资料与方法

1.1一般资料 于2021年5月至2022年6月构建糖尿病足大鼠动物实验模型,选取100只6周龄SD雌鼠为试验对象,将大鼠随机分为糖尿病足组及对照组各50只。大鼠群按照分组养于两只相同饲料笼。对照组体质量158～179 g,平均(164.34±5.19)g;糖尿病足组体质量159～179 g,平均(164.39±5.22)g。两组体质量无显著差异(P>0.05),组间可比。

1.2方法 两组均予以适应性饲养1 w:保持温度21～23 ℃,相对湿度50%～55%,自由饮水、进食,光照黑暗各12 h。1 w后,对照组给予普通饲料继续饲养,糖尿病足组给予高脂高糖饲料。第3周起,测量两组随机血糖后,糖尿病足组一次性腹腔注射1%链脲佐菌素(STZ)溶液(30 mg/kg,以0.1 mol/L柠檬酸缓冲液配制),对照组腹腔注射同体积0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液。注射STZ溶液后第3、7、14天时,测量两组随机血糖。当糖尿病足组随机血糖≥16.7 mmol/L则糖尿病模型建立成功。建立糖尿病模型成功后1 w,对两组静脉注射3%戊巴比妥钠行麻醉,采用薄铁片连续按压大鼠足部,并用冰醋酸连续涂抹,制作糖尿病足模型,待大鼠下肢出现红肿溃疡等异样变化,记录创面面积。

1.3观察指标 ① 造模过程中血糖水平变化:注射STZ溶液后第3、7、14天,检测随机血糖。② 观察两组创面造模第3、7、14天的创面愈合情况,计算创面愈合面积,愈合率=愈合面积/创口面积。③ 创面组织中β-catenin、糖原合成酶激酶(GSK)-3β表达情况:分别于创面造模后第3、7、14天,使用戊巴比妥钠麻醉大鼠,麻醉成功后,采集创面及创周2 mm的组织,将组织剪碎后置于机械组织匀浆器内,组织与裂解液按 1∶10 比例加入,冰浴30 min,4 ℃下离心半径6 cm,13 000 r/min 离心10 min,取蛋白提取液,采用酶联免疫吸附试验检测β-catenin、GSK-3β蛋白表达情况。④创面组织中β-catenin、GSK-3β mRNA表达情况。创面组织采集同③,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测β-catenin、GSK-3β mRNA表达情况。

1.4统计学方法 采用SPSS21.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1造模过程中血糖水平变化 注射STZ溶液前两组血糖水平差异不显著(P>0.05);注射后第3、7、14天,糖尿病足组血糖均显著高于对照组(P<0.05),见表1。

表1 两组造模过程中血糖水平及创面愈合情况

2.2创面愈合情况 创面造模第3、7、14天,对照组创面愈合率均显著高于糖尿病足组(P<0.05),见表1。

2.3β-catenin、GSK-3β蛋白和mRNA表达 创面造模后第3、7、14天,糖尿病足组β-catenin蛋白和mRNA含量均显著低于对照组,GSK-3β蛋白和mRNA均显著高于对照组(P<0.05),见表2、表3。

表2 两组创面造模后不同时间点β-catenin、GSK-3β蛋白表达

表3 两组创面创模后不同时间点β-catenin、GSK-3β mRNA表达

3 讨 论

多数糖尿病患者自感觉性神经受损,自感觉性神经病变可导致患者皮肤温度调节功能、血液循环能力及排汗调节功能等异常,造成局部组织柔韧性降低,再加上炎症因子、细胞因子的反复作用,导致皮肤开裂、破碎等。运动神经病变引起足内肌挛缩,导致姿势和协调缺陷,且会增加跖骨头压力,引起足部溃疡等,且血管病变又使破坏的组织难以愈合,继而导致糖尿病足的发生,并加重病情〔5～6〕。

糖尿病足是一种慢性疾病,且糖尿病足创面溃疡的愈合是一个长期、缓慢的过程,这个过程中成纤维细胞及表皮干细胞的激活、分化起重要作用,Wnt/β-catenin细胞信号转导通路是调控成纤维细胞及表皮干细胞分化的关键信号〔7～9〕。Wnt/β-catenin细胞信号转导通路能够促进创面血管新生、上皮重塑,诱导皮肤附件形成,促进创面愈合〔10～11〕。β-catenin是一种多功能蛋白,广泛分布于成纤维细胞、成骨细胞中,进入细胞核中可参与并影响基因的表达,调控这些细胞的增殖、分化及凋亡过程,β-catenin在Wnt信号途径中起细胞内信号转导的作用,且β-catenin稳定性增强仅仅依赖于Wnt信号途径〔12～14〕。GSK-3β是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,可调控糖原合成,参与调控细胞分化、凋亡、干细胞维持及肿瘤的发生等,GSK-3β能够负性调节Wnt细胞信号转导通路〔15～17〕。正常情况下,Wnt细胞信号通路关闭,细胞质中β-catenin水平极低,但当机体受到刺激,Wnt细胞信号转导通路被激活,Wnt与相关蛋白结合,信号传导,抑制β-catenin及GSK-3β被水解,造成β-catenin及GSK-3β在细胞质中积累,β-catenin进入细胞核,调节细胞的生长、分化〔18,19〕。有动物实验指出,糖尿病大鼠模型的溃疡创面中Wnt/β-catenin信号通路功能低下,β-catenin细胞阳性率低〔20〕。本研究提示,Wnt/β-catenin信号通路可能促进创面愈合〔21〕。