北极甜虾废弃物多肽钼螯合物的抗氧化性研究

◎ 刘雪凌，于 翠，亢 娜，林 贝，周莉莉

（燕京理工学院，河北 三河 065201）

微量金属螯合物可以补充人体微量必需矿物质。现阶段，市面上有无机盐金属矿物质补充剂、有机金属矿物质补充剂、氨基酸（蛋白质或多肽）金属矿物质补充剂等[1]。以北极甜虾虾壳为原料制备多肽钼螯合物，可以在降低环境污染的同时，利用虾壳生产高附加值产品，最大化利用虾类废弃物。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

北极甜虾虾壳，山东荣信水产食品集团股份有限公司提供；木瓜蛋白酶（800 μ/mg，生化试剂），山东卡贝因生物科技有限公司；无水乙醇（分析纯），山东德彦化工有限公司；磷酸氢二钠（分析纯），廊坊市金海化工有限公司；三氧化钼（分析纯），天津市光复精细化工研究所；氢氧化钠（分析纯），天津市永大化学试剂有限公司；盐酸羟胺（分析纯），重庆市茂荣化工贸易有限公司；DPPH·（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）（分析纯），北京百奥莱博科技有限公司；ABTS[2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐]（分析纯），酷尔化学科技有限公司；过硫酸钾（分析纯），河南铭之鑫化工产品有限公司；邻二氮菲（分析纯），随州佳科生物工程有限公司；硫酸亚铁（分析纯），济南裕景成林经贸有限公司。

1.2 仪器与设备

FA1004B电子分析天平，上海佑科仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥机，沧州晶硕试验仪器有限公司；pH计，烟台凯米斯仪器有限公司；HH-6恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；DT5-6低速台式离心机，北京时代北利离心机有限公司；UV-1601紫外分光光度计，北京北分瑞利分析仪器（集团）公司。

1.3 实验方法

1.3.1 北极甜虾虾壳多肽的制备

将提前烘干、粉碎的北极甜虾虾壳取适量，用无水乙醇脱色，过滤，滤渣用去离子水洗涤2～3次后，加入10%[酶的质量（mg）/溶剂体积（mL）]的木瓜蛋白酶溶液，在50 ℃、pH为4的条件下，制取虾壳多肽。利用旋转蒸发仪进行离心分离，取上清液放进烘箱进行烘干，即得虾壳多肽[2]。

1.3.2 北极甜虾虾壳多肽钼螯合物的制备

在虾壳多肽中按照北极甜虾虾壳多肽与三氧化钼质量比为1∶5，加入被氢氧化钠溶解的三氧化钼，螯合反应温度为55 ℃，螯合反应pH为6，螯合反应时间为120 min。用90%以上的乙醇进行沉淀，静置3 h，抽滤、干燥，即得北极甜虾虾壳多肽钼螯合物[3]。

1.3.3 北极甜虾虾壳多肽钼螯合物的抗氧化性研究

取适量北极甜虾虾壳多肽钼螯合物，对DPPH·、ABTS、·OH 3种自由基进行清除效果实验。整个研究探索了多肽钼螯合物浓度、反应时间、反应温度，对北极甜虾虾壳多肽钼螯合物抗氧化性的影响[4]。

（1）对DPPH·清除率的计算

用C2H6O（AR）配制0.1 mmol/L的DPPH溶液，阴暗处保存。将2.0 mL北极甜虾虾壳多肽溶液与2.0 mL该溶液混合。在强吸收波长处测吸光度（A1），空白组为2.0 mL无水乙醇加上2.0 mL的蒸馏水，测定其吸光度（A2），对照组为2.0 mL DPPH溶液加上2.0 mL的蒸馏水代替样品，测定其吸光度（A3），用2 mL蒸馏水和2 mL无水乙醇混合做对照[5]。公式计算如下。

（2）对ABTS清除率的计算

将1滴北极甜虾虾壳多肽溶液与ABTS工作液均匀混合，在阴暗处静置6 min。在734 nm波长处测吸光度，测定3次[5]。按以下公式进行清除率的计算。

式中，A0为不加样品，加入ABTS的吸光度；Ai为北极甜虾虾壳多肽与ABTS反应的吸光度。

（3）对·OH清除率的计算

取邻二氮菲溶液20滴至于试管中，依次加入缓冲液（pH为7.4）40滴、蒸馏水20滴、 硫酸亚铁溶液10滴，充分摇匀，加 H2O24滴，温度人体常温即可,恒温水浴锅中45 min，于536 nm处测其吸光度，其值称AD[7]。同前步，将其中用20滴蒸馏水代替H2O2测得的吸光度称AB。再用试样液1 mL代替第一步中的蒸馏水，测得的吸光度称As。

·OH自由基清除率计算公式如下：

2 结果与讨论

2.1 浓度对自由基清除率的影响

浓度对自由基清除率的影响见图1。从图1可以看出，不同多肽钼螯合物浓度对3种自由基的清除率均有影响，随着浓度的增加，对自由基的清除率也会增加。通过比较可知，多肽钼螯合物清除ABTS所需浓度最低。

图1 浓度对自由基清除率的影响图

2.1.1 多肽钼螯合物浓度对DPPH·清除率的影响

随着多肽钼螯合物的浓度增加，其与DPPH自由基的结合率越高，清除率逐渐上升，直至浓度达到6 mg/mL时，清除率几乎保持不变，表明已将DPPH自由基全部消耗，说明抗氧化性随着多肽钼螯合物浓度的增加而增加，在6 mg/mL时达到饱和状态。

2.1.2 多肽钼螯合物浓度对ABTS清除率的影响

随着多肽钼螯合物浓度的增加,其清除率逐渐增加直至不变。在0.5 mg/mL浓度以下，由于反应的逐步进行，越来越多的ABTS自由基被多肽钼螯合物还原，直至浓度高于0.5 mg/mL后，ABTS自由基全部被还原，清除率保持恒定，说明在0.5 mg/mL时反应已达到饱和状态。

2.1.3 多肽钼螯合物浓度对·OH清除率的影响

随着多肽钼螯合物浓度的增加，该清除能力不断加强。当浓度为9 mg/mL时，对·OH清除效果最好，高达91.9%。

2.2 反应温度对自由基清除率的影响

温度对自由基清除率的影响见图2。从图2可以看出，不同温度对3种自由基的清除率的影响规律相似，均是先升高后降低。通过比较可知，多肽钼螯合物清除DPPH·所需最适温度最低，其次是·OH，最后为ABTS。

图2 反应温度对自由基清除率的影响图

2.2.1 多肽钼螯合物反应温度对DPPH·清除率的影响

图2表明，清除率随着温度的增加而减小。导致清除率降低的原因可能是温度升高引起多肽钼螯合物结构改变，其多肽链越长该物质热稳性越差。由图2可见，此多肽钼螯合物在5 ℃清除效果最好。

2.2.2 多肽钼螯合物反应温度对ABTS清除率的影响

随着温度升高，清除率不断升高，40 ℃时达到清除率顶点值94.64%。40 ℃以后，清除率随着温度逐渐下跌，到50 ℃逐渐平稳。可知，温度为40 ℃为此反应的最佳温度。

2.2.3 多肽钼螯合物反应温度对·OH清除率的影响

当反应温度增加时，对·OH清除率不断攀升，30 ℃时，清除率达到最高点，高于30 ℃时，对·OH自由基的清除率逐步回跌。说明多肽钼螯合物在30 ℃时对·OH清除效果最好。

2.3 反应时间对自由基清除率的影响

反应时间对自由基清除率的影响见图3。从图3可以看出，不同温度对3种自由基的清除率的影响不同，对ABTS、·OH的清除率均是先升高后降低，而对于DPPH·的清除率则达到一定时间后趋于稳定。通过比较可知，多肽钼螯合物清除ABTS所需时间最短。

图3 反应时间对自由基清除率的影响图

2.3.1 多肽钼螯合物反应时间对DPPH·清除率的影响

多肽钼螯合对DPPH·清除率随着反应时间的增加而增加，在30 min后几乎不变。因此，最佳清除反应时间为30 min。

2.3.2 多肽钼螯合物反应时间对ABTS清除率的影响

随着反应时间的增加，多肽钼螯合物对ABTS自由基的清除率先增加后减小。反应5～10 min清除率达到稳定，为最佳反应时间。

2.3.3 多肽钼螯合物反应时间对·OH清除率的影响

当0 min时，羟自由基（·OH）清除率不到1%，可知此反应很缓慢。清除率随着时间推移而增高。40～50 min，羟自由基（·OH）清除率有所下降。反应时间为40 min时，对·OH的清除率为90.15%，为最大值。

3 结语

本研究利用北极甜虾废弃物进行多肽钼螯合物的制备，通过对其抗氧化性的研究探索，得知北极甜虾多肽钼螯合物具有一定的抗氧化性，不同自由基等氧化物的抗氧化条件不同，其抗氧化能力不同。今后的抗氧化性研究，应该结合多肽钼螯合物的制备工艺，不仅需要用螯合率作为比较指标，还需要增加抗氧化性指标，以提高该多肽钼螯合物的应用价值。