虚拟仿真软件辅助液相色谱分离条件的绿色优化实验

石志红，边刚，张红医，张博然

河北大学化学与环境科学学院，河北大学化学教学研究所，河北大学化学国家级实验教学示范中心，河北 保定 071002

高效液相色谱法(HPLC)是一种分离分析技术，在工农业生产、环境监测、食品安全检测等领域发挥着重要的作用[1]。它已成为高校化学及其相关专业仪器分析理论和实验课程的重要教学内容[2]。然而，在HPLC的实验教学中，与其他仪器分析实验教学相似，存在如下共性问题[3]：第一，实验内容基本不涉及实验条件的优化，学生只能被动按照设定的实验条件和步骤机械地完成实验，不能发挥学生的主观能动性；第二，大多数实验教材中将实验的条件、步骤都写得一清二楚，学生在实验过程中“照方抓药”，其分析、解决实际问题的能力和创造力得不到培养和提高。

导致上述问题的原因可以归结为以下两个方面：一是“实验时间延长”的制约。HPLC实验条件优化花费时间相对较长，所以在有限的学时内很难安排色谱条件优化实验。二是“化学废液增加”的制约。HPLC的流动相多为乙腈、甲醇等有机溶剂，如果每位学生都开展HPLC条件优化实验，势必大量增加有机废液，是与绿色分析化学要求背道而驰的，从经济学角度考虑也会导致废液处理支出的显著增加。

为了使学生在进行HPLC实验时既知其然也知其所以然，并且也不浪费太多的时间和试剂，基于虚拟仿真软件的HPLC优化方法就是一条行之有效的解决途径。很多研究机构和色谱工作者开发了各种色谱虚拟仿真软件。其中一些商用软件，比如Dry lab (Molnar-Institute)[4]和Chrom Sword (Iris Tech)[5]，由于价格昂贵，不利于推广应用。而有些免费的色谱软件，例如HPLC SIM需要在DOS系统下运行，HPLC Simulation需要在网页下运行。这些软件由于出现较早，在目前计算机软件环境下运行效果不佳[6]。HPLC Teaching Assistant[7]是一款显示软件，它可以给出溶液的酸碱度、柱温、等度洗脱、梯度洗脱等不同条件下的色谱分离结果，不过该软件只能显示非常有限的几种物质的分离情况。

HPLC Simulator是一款免费的开放HPLC条件优化软件，它是在明尼苏达大学Peter Carr教授所创建的用于HPLC优化的Excel电子表格基础上，由Paul Boswell和Dwight Stoll进一步发展成为单机版和web版本的HPLC条件优化模拟器[6]。作为一款简单、易于操作的HPLC模拟器，与Dry lab和Chrom Sword等软件相比，HPLC Simulator的突出优点就是作为免费软件便于推广应用。

同学们在掌握了简单的液相色谱基本原理基础上，能够很轻松地操作HPLC Simulator。首先，通过网址http://www.hplcsimulator.org/simulator.php下载免费软件。该软件没有使用时间限制，对计算机的操作系统也没有限制，适用性更强。同时软件在不断更新，甚至在网站上就可以完成色谱条件优化过程[8]。需要注意的是：该软件要求在Java环境下运行，在安装好相应的Java版本之后，启动该软件便能够使用。

在上述背景下，我们针对仪器分析实验教学中涉及的色谱进样操作实验和高效液相色谱法检测大黄蒽醌类化合物的实验提出了一种改进方案：在不延长学时的前提下将二者有机地结合起来，创新性地引入基于HPLC Simulator软件的色谱条件优化实验环节，由学生分工合作完成实验。实施路径如下：(1) 明确分离目标；(2) 根据软件模拟原理确定需要实验获得的参数；(3) 学生分组进行色谱预分离实验；(4) 全体同学共享实验数据，利用Origin软件进行线性或非线性回归获得虚拟仿真参数，并加入到软件数据库中；(5) 通过虚拟仿真软件实现HPLC分离条件的绿色优化，并将最优色谱条件输出；(6) 根据软件所给出的最优条件安排HPLC真实实验加以验证。

这样的改进措施不仅可以使原本枯燥的色谱进样操作练习转化为目标明确的探索性实验，而且可以使学生在诸多方面受益。首先，学生不仅可以掌握HPLC的基本操作，而且可以快速掌握HPLC分离条件优化方法；其次，学生利用虚拟仿真软件辅助HPLC分离条件优化，增强了将信息技术与专业相结合的意识；第三，学生通过分工协作完成实验，可以更好地培养团队合作精神。更重要的是，为实际样品的HPLC分离条件优化提供了新思路，增强了学生解决实际问题的能力。

1 实验部分

1.1 实验原理

HPLC Simulator在进行模拟前，需要在数据库中添加待分离化合物。HPLC Simulator是一款开放的软件，它可以在自身的20多种化合物数据库的基础上，允许用户根据实际需要扩充数据库中化合物的种类。成为HPLC Simulator数据库的合格化合物需要有该化合物的四个参数：a'、b'、A'和B'。它们的计算公式如下：

式中k为溶质的保留因子，tR为保留时间，t0为死时间。Ф为流动相中有机改性剂的体积分数，S为溶质的溶剂强度参数，kw为纯水作流动相时溶质的保留因子，T为温度。S和kw均为与温度有关的量。根据以上关系式，可以设计一系列实验来获取欲加入HPLC Simulator数据库的化合物的a'、b'、A'和B'值。

固定色谱柱温度T1，改变流动相Ф值分别为Ф11、Ф12、Ф13、Ф14和Ф15(下角标的第1个数字代表着温度条件序号；下角标第2个数字代表着流动相体积分数序号)，进样测定，记录所对应的保留时间tR11、tR12、tR13、tR14和tR15。改变色谱柱温度为T2、T3、T4和T5，继续进行实验，实验安排如表1所示。

表1 获取化合物的四个特征参数(a'、b'、A'和B')的实验设计

将实验获得的tR数据代入公式(1)求出所对应的k，将Ф和对应的k代入方程(2)进行拟合，求出对应的lgkw和S。将T和相应的lgkw代入方程(3)进行拟合，求出a'和b'值。将T和对应的S代入方程(4)进行拟合，求出A'和B'值。

图1为HPLC Simulator的主界面。该模拟器左侧为工具栏，分为六个主要的板块：① 流动相：可选择水、乙腈等；流动相的比例；洗脱方式：选等度洗脱或梯度洗脱方式；② 绘图选项：溶剂B的体积分数、背压、流动相的粘度、待测组分的保留因子、待测组分在色谱柱中的位置；③ 色谱性能选项：温度、进样体积、流速、柱效、塔板高度、理论塔板数、背压；④ 一般性能选项：洗脱剂的粘度、扩散系数、时间常数、信号漂移、噪声、自动测定时间范围、起始时间、终止时间、绘图点；⑤ 色谱柱性能选项：固定相(类型、柱长、内径、颗粒大小、颗粒间的尺寸、总孔隙度)、死体积、死时间、van Deemter方程选项(涡流扩散项系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数)、塔板高度；⑥ 其他选项：柱后管路(长度、内径、体积)。

图1 HPLC-Simulator软件的主界面

模拟器的右侧为图像显示区：根据色谱条件的变化，软件能够即刻绘制出待测物质的色谱峰，节约了探究色谱条件的时间，而且节省了大量的有机试剂，减少了对环境的污染，符合绿色化学的理念。在色谱图的下方会显示出待测物质的出峰时间、保留因子、峰宽等试验结果。软件也能够对图像区域进行简单的放大和缩小，调整谱图的范围。

图2为Add New Compound操作的主界面，将待分离化合物的a'和A'值填入intercept数值框，b'和B'值填入相应的slope数值框，就能在模拟器中显示出该化合物的色谱图。改变色谱条件，根据模拟器给出的色谱图可对色谱分离条件不断进行优化。

图2 Add New Compound操作的主界面

1.2 试剂

芦荟大黄素(97.5%)、大黄酸(99.3%)、大黄素(96.0%)、大黄酚(99.4%)和大黄素甲醚(99.2%)标准品(中国食品药品检定研究院)，甲醇(色谱纯，迈瑞达试剂有限公司)、磷酸(分析纯，梯希爱化成工业发展有限公司)。实验用水为二次蒸馏水。

1.3 仪器

LC-20AD高效液相色谱仪(岛津，日本)，配有SPD-20A紫外/可见分光光度检测器，Rheodyne7725i手动进样阀(美国)，LC solution Lite工作站和AT-330色谱柱恒温箱(天津市奥特赛恩斯仪器有限公司)。EX125DZH分析天平(精度0.01 mg，常州奥豪斯仪器有限公司)。

色谱条件：色谱柱：Hubble反相C18柱(150 mm × 4.6 mm，5.0 μm，Omni公司)；流动相：溶剂A，0.1%磷酸水溶液(V/V)；溶剂B，甲醇；流速1 mL·min-1；柱温30 °C；检测波长254 nm；进样量5 μL。

1.4 实验步骤

1.4.1 大黄蒽醌类化合物标准溶液的配制

精密称定大黄蒽醌类化合物标准品，用甲醇溶解配制成浓度为100 μg·mL-1的标准储备液，实验前取标准储备液用甲醇稀释制备成浓度为5 μg·mL-1的标准工作液。

1.4.2 大黄蒽醌类化合物预分离实验

按照表1具体安排色谱预分离实验，其中T1、T2、T3、T4和T5分别设为27、30、35、40和45 °C。甲醇的Φ值分别设为80%、83%、85%、87%和90%。每位同学认领一个实验条件，平行进样3次，得到大黄蒽醌类化合物的保留时间数据，使用同一台高效液相色谱仪的同学共享保留时间数据。

1.4.3 数据拟合求出a'、b'、A'和B'值

将预分离实验所获得的保留时间数据代入方程(1)计算出保留因子k，然后将k和流动相中有机改性剂的体积分数Ф代入方程(2)进行拟合，求出对应的lgkw和S。最后根据方程(3)和(4)进行拟合，求出a'、b'、A'和B'值。

1.4.4 HPLC Simulator软件模拟优化色谱条件

将各化合物的数值输入HPLC Simulator，改变色谱条件，根据模拟器给出的色谱图对色谱分离条件进行优化。

1.4.5 实验验证

在高效液相色谱仪上对HPLC Simulator软件模拟优化的色谱条件进行实验验证。

2 结果与讨论

2.1 HPLC Simulator对大黄蒽醌类化合物色谱分离条件的优化

2.1.1 将大黄蒽醌类化合物的相关数据添加到软件数据库中

由于HPLC Simulator在进行模拟前，需要在数据库中添加待分离化合物。作为合格入库化合物必须提供a'、b'、A'和B'四个参数。按照表1的设计进行实验，将获得的数据代入方程(2)进行拟合，求出对应的lgkw和S。最后代入方程(3)和(4)进行拟合，求出a'、b'、A'和B'值。表2列出了五种大黄蒽醌类化合物在不同温度下的lgkw和S值，表3列出了最终获得的五种大黄蒽醌类化合物的a'、b'、A'和B'四个特征常数值。

表2 五种大黄蒽醌类化合物在不同温度下的lgkw和S值

表3 五种大黄蒽醌类化合物的四个特征常数值

2.1.2 色谱分离条件的虚拟仿真优化

将大黄蒽醌类化合物的a'、b'、A'、B'数据填入HPLC Simulator模拟器中(如图2所示)，这些化合物就成为数据库中的合格化合物了。HPLC操作一般有两种洗脱方式：等度洗脱和梯度洗脱。前者主要针对简单混合物体系的分离，而后者主要是针对复杂混合物体系的分离，梯度洗脱往往具有更高的使用价值。为此，设定了a、b、c、d、e和f六个梯度洗脱程序，如表4所示。

表4 六种模拟的梯度洗脱条件

图3为HPLC Simulator给出的模拟分离结果。在a和b的梯度条件下五种化合物的保留时间相对较长，而最后出峰的大黄素甲醚峰形宽且矮。在c、d、e、f的梯度洗脱条件下五种化合物能够在10 min内完全分离，大黄素甲醚的色谱峰明显变窄，色谱峰增高，有利于定性和定量分析，但最终选择哪一个色谱分离条件应用于实际样品分析，还要进行实验验证。

图3 六种梯度条件下大黄蒽醌类化合物的HPLC Simulator模拟色谱图

2.2 实验验证

HPLC Simulator软件给出的分离条件是否可靠？为了回答这个问题，进行了验证实验。验证实验是在LC-20AD高效液相色谱仪(岛津，日本)上完成的，梯度条件与表4相同。图4为六种梯度条件下大黄蒽醌类化合物的实际色谱图。对比图3和图4的结果可以发现：首先，对于五种化合物的保留顺序，实验结果与模拟结果完全一致。其次，五种化合物的保留时间随流动相中甲醇含量变化的趋势完全一致。再次，大黄素甲醚的色谱峰形随流动相中甲醇含量变化的趋势也完全一致。当然，我们可以观察到：模拟色谱图和实际色谱图中相应色谱峰保留时间存在一定差异。这与色谱系统的死体积以及色谱柱的装填情况等因素有关。从图4可以看出，在实际分离中，a、b、c保留时间长，尤其a、b中大黄素甲醚的峰明显变宽。而e和f中大黄酸与后面的杂质峰分离度不够大，因此最终选择d的梯度洗脱条件为最佳色谱分离条件用于大黄蒽醌类化合物的检测。本文所确立的梯度洗脱方法总分离效果优于文献[9]的方法，对于保留时间最长的大黄素甲醚，分析时间可控制在10 min以内，而文献[9]中大黄素甲醚的分析时间接近34 min。

图4 六种梯度条件下大黄蒽醌类化合物的实际色谱图

3 教学组织实施

本科生“仪器分析实验”共开设15个实验，其中包括两个液相色谱实验。第3-7周开设“高效液相色谱仪结构、工作原理和操作技术练习”实验，第13-17周开设“高效液相色谱法测定大黄蒽醌类化合物的含量”实验，每个实验4学时。以50人的班级为例，将学生分为五组，每组10人。仪器分析实验课每次同时开设5个不同实验，5组同学按照实验运行表进行轮转。在第3-7周，每周有一组同学进行“高效液相色谱仪结构、工作原理和操作技术练习”实验，每5位同学共用一台高效液相色谱仪。学生在上课之前要预习实验，下载并练习HPLC Simulator软件的使用。每周课上教师按照表1的设计将某个柱温下的5种不同流动相配比的进样实验分配给共用同一台仪器的5个学生，得到某个温度下5种流动相组成时大黄蒽醌类化合物的保留时间。五周后五个温度下的不同流动相比例对应的25个保留时间数据均已获得。教师将收集汇总的保留时间数据共享给使用同一台高效液相色谱仪的同学。学生课下进行HPLC Simulator软件模拟，将软件模拟结果附在实验报告上提交。在第13-17周开设的“高效液相色谱法测定大黄蒽醌类化合物的含量”实验中，学生对软件模拟得到的最佳色谱条件进行实验验证，并进行大黄蒽醌类化合物的测定。对学习效果的评价从预习报告、课堂表现、实验操作和实验报告几方面进行，各部分占比分别为10%、20%、40%和30%。这样的改进措施和实验安排使原本枯燥的色谱进样操作练习转化为目标明确的探索性实验，大大激发了学生对色谱的学习兴趣。通过课程的学习，学生不仅可以掌握HPLC的基本操作，而且可以快速掌握HPLC分离条件的优化方法。在使用HPLC Simulator软件进行色谱条件模拟优化时，学生可以更直观地了解影响柱效和分离度的各个因素，既知其然又知其所以然，改变了“照方抓药式”的实验课学习模式，为液相色谱初学者提供了更为丰富的学习体验。

4 方法的可推广性及局限性

方法的可推广性体现在如下几个方面：(1) 本文是将色谱进样操作练习和大黄蒽醌类化合物的检测实验结合起来，增加了虚拟仿真软件辅助色谱条件优化的教学内容。这种方式把原本枯燥的色谱进样操作练习升华为目标明确的探索性实验，调动了学生的学习积极性。这个方法可以推广应用到其他化合物的液相色谱检测实验，无需延长学时，也不需要增加仪器设备。(2) HPLC Simulator是一款免费的软件，这款软件没有使用时限，对计算机的操作系统也没有限制，适用性强。软件操作简便、易于掌握，便于推广应用。(3) 使用HPLC Simulator软件模拟，可以使学生快速掌握色谱条件的优化方法，同时可以更直观地了解影响柱效和分离度的各个因素，增强学生的学习效果。(4) 采用虚拟仿真软件辅助液相色谱条件优化，减少了色谱流动相溶剂的使用和废液的产生，符合绿色分析化学的发展趋势，值得推广。

方法的局限性在于：虚拟仿真软件HPLC Simulator提供的流动相溶剂种类和色谱柱类型不够多，有些情况需要近似处理。

5 结语

本文介绍了一种基于虚拟仿真软件HPLC Simulator的液相色谱分离条件的绿色优化方法。将色谱进样操作练习和大黄蒽醌类化合物的检测实验结合起来，在不延长学时的前提下，可以使学生在掌握HPLC基本操作的同时快速掌握HPLC分离条件优化方法。利用HPLC Simulator优化色谱条件省时省事节约溶剂，符合绿色化学理念。将本文介绍的方法应用于本科生实验，可以增强学生将信息技术与专业学习相结合的意识。通过分工协作共享实验数据可以更好地培养学生的团队合作精神。