治疗COVID-19的小分子药物研究进展

袁博，冯辰昀，袁耀锋

1 福州大学化学学院，福州 350108

2 国家药品监督管理局南方医药经济研究所，广州 510080

3 南方科技大学化学系，广东 深圳 518055

1 简介

自从2019年新冠肺炎(COVID-19)疫情全球大流行以来，已经给人类社会造成了不可估量的损失。COVID-19患者可见发烧、咳嗽、呕吐、疲劳等症状，重症患者可能会出现呼吸衰竭、休克[1,2]。截至2022年11月13日，全球已报告超过6.32亿例确诊病例和超过650万例死亡病例[3]。

COVID-19疫情是全球范围内的复杂卫生事件，需要科学家、公共卫生专家、医学专家和社会工作者的共同努力来终结这一事件。在科学层面，需要解决以下两个主要问题：一是如何阻断SARSCoV-2在人群中的传播；二是如何有效地治疗COVID-19患者。化学研究方法和工具是解决这两个问题的重要手段。

SARS-CoV-2疫苗从一定程度上遏制了SARS-CoV-2在人群的传播，可以预防新冠感染，降低新冠肺炎患者的重症率和死亡率[4-6]。mRNA疫苗技术是人类首次大规模使用的新技术，mRNA疫苗研发周期更短，可以快速量产，在应对突发公共安全事件中具有一定优势，但同时面临着mRNA分子的稳定性和递送效率低等技术困难，化学工具是解决此类技术问题的关键：研发人员通过对mRNA分子的修饰提高mRNA分子的稳定性，例如对mRNA分子的5’帽子结构进行化学修饰、插入人工合成核苷酸；通过开发和优化高效的纳米粒递送系统，进一步提高mRNA的递送效率和靶向能力[7]。

小分子药物主要指化学合成药物，在救治COVID-19患者中起着重要作用，具有给药方便、有利于大规模生产以及不容易激发免疫反应等优势(同大分子药物相比)。截至2022年9月，在FDA批准的抗病毒药物清单中，总共有118种疗法，其中包含了103种小分子化学药物。FDA公布的紧急使用授权(EUA)药物名单中共有8个抗病毒药物，其中包含了2种小分子化学药物[8-10]。在美国国立卫生研究院(NIH)发布的The Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) Treatment Guidelines 与国家卫生健康委发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第九版)》中，对一些中度、重度患者的救治方案中采用小分子化学药物作为治疗方案，其中也包括帕克洛维德(PaxlovidTM)等药物(表1)。

表1 部分COVID-19治疗相关的小分子药物

治疗COVID-19患者的小分子药物主要包括抑制SARS-CoV-2病毒和控制人体细胞因子风暴等两类药物。其中抑制SARS-CoV-2小分子药物的靶点以RdRp和Mpro为主。SARS-CoV-2是一种正链RNA病毒，它的基因组大小约为30 kb，有14个编码开放阅读框(ORF)。其中5’-ORF-1a/1b占SARS-CoV-2基因组的67%，5’-ORF(ORF1a/b)编码形成16种非结构蛋白(nsp1-16) (图1)[11]。这些非结构蛋白构成病毒生命周期所需的多种重要的酶，其中就包括了RdRp和Mpro。研究人员通过开发对RdRp或Mpro产生作用的化合物，抑制SARS-CoV-2的复制。目前已经上市的COVID-19治疗药物中以RdRp为靶点小分子药物有阿兹夫定(Azvudine)、莫匹拉韦(Molnupiravir)、瑞德西韦(Remdesivir)，以Mpro为靶点的小分子药物有PaxlovidTM。

图1 SARS-CoV-2的基因组图

在临床应用中，控制SARS-CoV-2引起人体的细胞因子风暴有助于降低重症患者的死亡率，因此在治疗COVID-19的临床指南中，也包括部分细胞因子抑制药物用以辅助治疗，具有代表性的就有地塞米松(Dexamethasone)、巴瑞克替尼(Baricitinib)[12](表1)。

鉴于一个全新的小分子药物研发上市需要大约10年左右，为了加速药物的研发的过程，以上药物主要采取了“老药新用”的研发策略，通过增加已上市药物的适应症来缩短药物研发周期。例如，瑞德西韦在COVID-19爆发前已获批上市，是埃博拉病毒、尼帕病毒、呼吸道合胞病毒等多种病毒的广谱性药物。疫情爆发后，该药通过增加治疗新冠肺炎的适应症而获批用于COVID-19的治疗[13]。

2 以RdRp为靶点的小分子药物

RdRp是RNA依赖性RNA聚合酶(The RNA-dependent RNA polymerase)的简称，也被称为NSP12，需要在NSP7和NSP8的协同激活下才能具有聚合酶活性[14]，因此NSP12-NSP7-NSP8被定义为SARSCoV-2中RNA复制的最小核心单位，SARS-CoV与SARS-CoV-2的NSP12在活性位点的结构上高度相似，有助于指导药物设计[15]。另外由于哺乳动物细胞体内不存在RdRp的对应物，以RdRp为靶点的药物对哺乳动物细胞的影响较小，因此RdRp是一个优异的RNA病毒药物靶点。

2.1 Azvudine

Azvudine (2’-deoxy-2’-β-fluoro-4’-azidocytidine) (FNC)是中国本土研发并成功上市的首款SARSCoV-2小分子药物，也是中国首个以辅助蛋白Vif与逆转录酶为双靶点的抗艾滋病毒(HIV)药物。Azvudine治疗COVID-19的靶点为RdRp，是在抗HIV药物的基础上增加治疗COVID-19适应症的方式在中国上市。在该公司在III期临床试验中，40%的COVID-19患者在接受Azvudine治疗一周后表现出临床症状改善，而接受安慰剂的患者中这一比例仅为11%[16]。

Azvudine属于前药，不直接抑制病毒复制，它在细胞中进行三磷酸化产生FNC三磷酸，继而产生对丙肝病毒(HCV)、肠道病毒71型(EV71)、SARS-CoV-2等病毒的广谱抑制活性。FNC三磷酸已在细胞培养和动物模型中被证明可有效抑制SARS-CoV-2，该结论通过FNC的单磷酸类似物进行验证，其中Vero E6细胞中抑制SARS-CoV-2的半数有效浓度(EC50)为4.3 μmol·L-1，半数细胞毒性浓度(CC50)是66.15 μmol·L-1(qRT-PCR，48h)，Calu-3细胞中抑制SARS-CoV-2的EC50为1.2 μmol·L-1，CC50＞ 102.4 μmol·L-1(qRT-PCR，48h)[17]。Azvudine通过与RdRp靶点结合，抑制病毒RNA的合成，阻断病毒复制。以抑制SARS-CoV-2病毒复制为例，Azvudine的三磷酸化产物作为底物与SARS-CoV-2的RdRp结合，导致病毒RNA链合成终止，产生并无功能的病毒基因组RNA，进而阻断病毒复制(图2)[18,19]。

图2 Azvudine的抗病毒原理[16]

Azvudine是核苷类似物，在其药物设计中，Azvudine核苷母核4’-取代基的引入提高了酶和酸的稳定性，并使核苷更亲脂性，从而提高了细胞渗透性和生物利用度。另外Azvudine核苷母核4’-叠氮基团通过空间效应稳定了3’-C-endo的构象，并与核苷母核3’-OH基团形成分子内氢键，从而降低了3’-OH的亲核性，改善了其生物活性。在一项Azvudine治疗HIV感染的临床试验中(NCT04109183)，共有172名受试者参与该试验，Azvudine没有显示出严重的不良反应，表现出理想的药代动力学，并达到了疗效终点[19]。相较于Remdesivir，Azvudine的患者依从性较好，由于具有良好的生物利用度，Azvudine可口服给药，且给药剂量每天不超过5 mg，但Remdesivir口服生物利用度较低，必须注射给药，且首日给药剂量为200 mg，次日给药剂量为100 mg。

在一组临床试验(ChiCTR2000029853)中，研究人员招募了20名COVID-19患者，通过随机分配开展Azvudine的临床试验，其中包括对照组和给药组(FNC组)，FNC组治疗4天后的核酸转阴率为100%，而对照组转阴率仅为30%；FNC组治疗6天后核酸转阴率为100%，对照组转阴率为40%；两组对照均存在显著差异(p= 0.0013和p= 0.0011) 。FNC组的首次核酸阴性转换时间比对照组更低，对比之前轻、中COVID-19患者的氯喹治疗研究，结果也较显著[20-22]。总体上，Azvudine是一种安全、有效、治疗依从性好的抑制SARS-CoV-2药物。

2.2 Molnupiravir

由默克公司(Merck)研发的Molnupiravir (MK-4482，又称EIDD-2801)是一种口服核糖苷类似物，对流感、SARS、埃博拉等RNA病毒具有良好的抑制活性，其COVID-19适应症于2022年8月5日获得FDA紧急使用授权(EUA)。Molupiravir在体内被吸收之后被血浆脂酶转化为核糖核苷类似物β-d-N4-羟基胞苷(NHC或EIDD-1931)，随后，NHC会被宿主细胞激酶磷酸化，形成NHC5’-三磷酸(NHC-TP)，SARS-Cov-2病毒的RdRp把NHC-TP当做的底物，替代三磷酸尿嘧啶核苷酸或者三磷酸胞嘧啶核苷酸[23](图3)。因此当RdRp使用正链基因组RNA (+gRNA)作为模板合成负链基因组(-gRNA)会结合NHC-TP，形成具有问题的-gRNA[24]，导致正链RNA产物的突变，影响病毒的复制(图3)。

图3 Molnupiravir对SRAS-CoV-2的作用原理

在一项随机、双盲、安慰剂对照研究中(NCT04392219)，Molupiravir具有良好的耐药性，且吸收良好。当在50-1600 mg剂量之间给药时，其母体核糖核苷类似物EIDD-1931在血浆表现出线性的并与剂量成正比的药代动力学特征。研究显示50-800 mg每天两次给药5.5天和单次剂量高达1600 mg的范围是安全且耐受性良好的。虽然单次递增给药与多次递增给药后，患者会发生头痛与腹泻，但Molnpiravir组在头疼比例上小于安慰剂组(12.5%vs. 18.8%)，在腹泻比例上Monpiravir组与安慰剂组持平(7.1%)。只有一例患者因为皮疹而停止给药，没有患者出现严重不良现象[25]。

在随后的II期、双盲、随机、安慰剂对照组实验中(NCT04405570，n= 202)证明，通过Molnupiravir治疗可以降低COVID-19患者的核酸转阴时间。在接受800 mg Molnupiravir的受试者中，92.5%的受试者在研究结束时(4周)实现了病毒RNA清除，而安慰剂受试者的这一比例为80.3%。在不良反应中，200-800 mg的治疗组与安慰剂对照组不良反应率相似，且Molnupiravir仅发生轻度不良反应。该研究II期临床试验的安全性分析与I期相似[26]。

在一项有1433人参加的III期、双盲、随机、安慰剂对照试验中(NCT04575597)，研究人员发现，在COVID-19发病的早期/中期通过接受Molnupiravir治疗可以降低患者的住院、死亡率。经过29天治疗，有7.3%接受了Molnupiravir治疗后住院、死亡，但是安慰剂对照组为14.1%。尽管Molnupiravir组和安慰剂组在不良反应发生率相似(Molnupiravir组为30.4%，安慰剂组33.0%)，但是发生不良反应导致死亡的比例中Molnupiravir组小于安慰剂组(0.3%vs. 1.7%)。研究人员认为发生不良反应与实验方案设计无关[27]。

基于上述的研究，研究人员认为Molnupiravir适合应用于轻、中症状的COVID-19的患者治疗。

2.3 Remdesivir

Remdesivir (RDV，GS-5734)是一种1’-氰基取代的腺苷核苷酸类似物前药，最初的研发目的是利用抑制RNA合成的机制来治疗埃博拉病毒感染。它在体内首先单磷酸化(RDV-MP，GS-441524-MP)，随后在通过激酶进一步转化为三磷代谢物的形式(RDV-TP) (图4) 。RDV-TP与三磷酸腺苷的结构非常相似，它可以参与病毒的RNA复制过程，并结合在RNA链的i位置，这个过程会导致RNA链在i+ 3位置停止合成。体外实验中Remdesivir已经显示出抗病毒活性，Remdesivir在原代人呼吸道上皮细胞(HAE)中针对SARS-CoV的半数抑制浓度(IC50)为0.069 μmol·L-1，针对MERS-CoV的IC50为0.074 μmol·L-1；在SARS-CoV-2有关的研究中，Remdesivir在Vero E6细胞中也具有一定的抗病毒活性(EC500.77 μmol·L-1)。

图4 Remdesivir在体内的转化模型

Remdesivir治疗COVID-19的临床疗效目前仍存在争议。2020年10月吉利德科学发布了关于Remdesivir的最终报告(NCT04280705)，共有1062人进行了随机分组，报告显示运用Remdesivir进行治疗可以减少患者的中位数治疗持续时间(10天vs.15天，均95%置信区间)。Remdesivir治疗组相比于安慰剂组更有可能在15天时出现临床改善。Kaplan-Meier曲线中Remdesivir组的死亡率为6.7%，而安慰剂组为11.9%，而在29天时Remdesivir组死亡率为11.4%，而安慰剂组为15.2%[28]。另一项由法国国立卫生研究院主导的研究(NCT04315948)显示，Remdesivir对住院患者的死亡率与治疗三个月患者的死亡率没有显著的影响[29]。这类结果只能证明Remdesivir可以帮助患者在临床意义上改善COVID-19病情，但是在中、重度患者的疗效不确切。

美国国立卫生研究院(NIH)在The Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) Treatment Guidelines中只对高危、非住院患中推荐使用Remdesivir。在中国卫健委发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第九版)》中，Remdesivir未在抗病毒药物名录中。

3 PaxlovidTM：以Mpro为靶点的抗SARS-CoV-2小分子药物

SARS-CoV-2的Mpro是一种33.8 kDa的蛋白质，主要负责病毒多蛋白的蛋白水解切割。在切割蛋白前对蛋白酶加以靶向抑制，可进一步影响成熟病毒的组装，因此该蛋白酶通常会被视为一种潜在、有效的靶点[30]。SARS-CoV-2 Mpro抑制剂一般通过共价/非共价键形式，使得分子与蛋白酶相互作用，进而抑制SARS-CoV-2的Mpro活性。PaxlovidTM被认为是较具治疗潜力的此类药物，该药由辉瑞公司研制，已获得FDA的紧急使用授权(EUA)，适用于轻度、中度COVID-19患者的治疗。在我国，PaxlovidTM也获得附条件批准进口上市，并被写入《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第九版)》，作为抗病毒临床推荐药物。

PaxlovidTM由Nirmatrelvi和Ritonavir两种化合物组成，是一种典型的复方药物。Nirmatrelvi是一种以Mpro为靶点的新型蛋白酶抑制剂，通过抑制Mpro来阻断SARS-CoV-2复制。Ritonavir则是一种细胞色素P450 3A4抑制剂，不直接参与抑制SARS-CoV-2，但可以通过降低Nirmatrelvi代谢并增加其血清浓度，提升Nirmatrelvi的抗病毒效果。

2022年2月，由辉瑞公司提交的一项PaxlovidTM的II/III期随机、双盲、安慰剂对照临床试验报告(NCT04960202)中显示，PaxlovidTM可以降低轻型、中型COVID-19患者的病情恶化率。共有2246名患者接受了随机分组；1120名患者在PaxlovidTM组，1126名患在安慰剂组。接受治疗第28天，PaxlovidTM组患者的COVID-19相关住院或死亡发生率均远低于安慰剂组；其中PaxlovidTM组的COVID-19发病率为0.77%，而安慰剂组的发病率为7.01%。在治疗的第5天，患者体内PaxlovidTM的病毒载量低于安慰剂组。两组在治疗期间出现的不良事件发生率相似(22.6%vs. 23.9%)；但是PaxlovidTM组的总体患者的不良反应的严重程度小于安慰剂组，严重不良事件分别为1.6%和6.6%。PaxlovidTM组比安慰剂组更频繁地发生味觉障碍(5.6%vs. 0.3%)和腹泻(3.1%vs. 1.6%)[30]。

另一款与Paxlovid类似的药物是洛匹那韦-利托那韦(Lopinavir-Ritonavir)。洛匹那韦(Lopinavir)是一种肽模拟药物，主要用于HIV-1的治疗。在体外实验中，Lopinavir-Ritonavir被证明可以降低SARSCoV-2病毒滴度，研究者推测，这可能与抑制Mpro活性有关，学界对此存在争议，有研究表明这种情况的出现似乎与Ritonavir有关[31,32]。在SARS-CoV-2的相关研究中，也暂时没有研究可以证明Lopinavir在临床上有效，与之相关的研究仍在进行中。

4 免疫治疗药物

4.1 Dexamethasone

Dexamethasone ((11β,16α)-9-Fluoro-11,17,21-trihydroxy-16-methylpregna-1,4-diene-3,20-dione)是一种皮质类固醇免疫抑制剂。早在20世纪70年代，世界卫生组织(WHO)就已经将Dexamethasone列入WHO的基本药物的使用清单中[33]。目前Dexamethasone主要被应用于各种炎症和过敏性疾病、皮肤病的诊治中，例如：系统性狼疮、类风湿性关节炎、过敏性鼻炎、支气管哮喘、接触性和特应性皮炎等[34]。

控制COVID-19患者体内的细胞因子水平是救治中度、重度患者并降低患者死亡率的关键。在SARS-CoV-2的刺突蛋白作为受体与血管紧张素转化酶2 (AEC2)大量结合后，会促发系列复杂因子的表达，最终导致肺部的过度炎症与细胞因子风暴。如果不加以控制，患者的病情会继续恶化，后出现弥漫性肺损伤、呼吸衰竭甚至死亡[35]。因此除了抑制SARS-CoV-2的复制之外，控制COVID-19患者体内的细胞因子水平也显得十分重要[36]。

Dexamethasone对炎症反应过程有抑制作用，在胸腺细胞中与糖皮质激素受体的结合，通过一系列信号通路诱导了caspase-8/caspase-3的活化，促使细胞凋亡，抑制免疫反应[35]。同时Dexamethasone还可以通过CD28通路抑制成熟T细胞的增殖，可有助于降低人体内细胞因子的表达[37]。

有研究指出，Dexamethasone可以将使用呼吸机的COVID-19患者死亡率降低1/3[34]。在一些抗病毒药物的试验中，Dexamethasone也作为了一种重要/辅助治疗手段。例如在登记为NCT04425863研究中，研究人员在研究伊维菌素(Ivermectin)的药效时，搭配的辅助药物就是Dexamethasone。在另一项关于Dexamethasone辅助治疗的试验(NCT04381936)也显示Dexamethasone可以降低患者死亡率。一项早期研究中，在随机分配的基础上，2104名患者在接受Dexamethasone额外治疗后28天后死亡率为22.9%，而拥有4321名患者的常规治疗组死亡率为25.7%；但是如若对比两组中需要呼吸通气的患者的存活/死亡数据则有很大差距(29.3%vs. 49.2%)[38]。

但是Dexamethasone的使用有可能增加动脉粥样硬化、高血压、糖尿病和骨质疏松症等疾病的风险；在一项动物试验中，研究人员也发现Dexamethasone的使用会导致大鼠体重上升、高血糖与骨质疏松[39]，因此在非重症患者的体内，不建议使用Dexamethasone进行辅助治疗。

4.2 Baricitinib

Baricitinib (INCB28050)是一种可逆的Janus相关激酶(JAK)抑制剂，广泛被运用于治疗中度、重度的类风湿性关节炎(RA)[40]。它对AP2相关激素酶(AKK-1)具有很强的亲和性，对细胞周期蛋白G激素酶(GAK)具有一定的亲和性，因此可以阻断病毒进入细胞与病毒在细胞内部的运输。同时Baricitinib可以选择性地抑制JAK1/JAK2酶、靶向细胞因子和刺激生长因子的受体活性，并会中断一部分这类细胞因子通路，进而导致IL-6、IL-2、IL-10、INF-γ在内的众多细胞因子水平下降，因此可用于救助中、重度COVID-19患者[41]。

Baricitinib于2022年5月获得FDA的紧急使用授权(EUA)，向需要补氧/有创机械通气/ECMO、年龄≥ 2岁的住院COVID-19成人和儿科患者提供治疗。目前的临床数据显示，在接受Baricitinib治疗的COVID-19患者会出现炎症标志物的减少与氧合改善[42]。在一项大型、双盲、随机安慰剂实验中(NCT04401579)，研究发现，接受Baricitinib与Remdesivir联合治疗的患者相比于单独接受Remdesivir治疗中位恢复时间更低(7天vs.8天)、第15天的临床改善现象提高30%；在接受高流量氧气、无创通气的患者中，接受Baricitinib的辅助治疗效果也更明显[43]。Baricitinib在临床应用中与Dexamethasone相似，有研究(EUPAS34966)指出在中、重度患者的救治中，联合使用Baricitinib与类固醇药物具有更好的疗效，肺功能在出院后可以得到更大的改善[44]。但是对于无症状、轻症状(非住院)患者，目前尚无临床数据表明Baricitinib疗法是有效、安全的[45]。

5 结语

现有研究显示，小分子药物在救治COVID-19患者中起到了重要作用，是抑制SARS-CoV-2复制、阻断COVID-19患者细胞因子风暴的重要治疗方法。药物再利用是这类药物发现的主要策略，研究人员利用与SARS-CoV-2序列同源性高、酶结构保守的SARS-CoV和MERS-CoV的前期研究成果，成功开发数个抑制SARS-CoV-2的小分子化学药物，缩短了研发周期，有利于较快应对突发公共卫生事件。

在抑制SARS-CoV-2复制的药物中，除了Mpro和RdRp两个已上市药物靶点外，木瓜样蛋白酶(PLpro)也被认为是相关药物设计的关键靶点，在病毒复制以及干扰宿主的免疫应答等多种功能中发挥作用，是未来研究的趋势之一[46]。相关候选药物中，研究者已经报导了GRL0617及其几个类似物对SARS-CoV-2表现出一定的抑制作用[47]。

除了常规的药物设计和筛选模式，人工智能在辅助开发COVID-19小分子化学药物也具有一定应用前景。2020年2月，Richardson P.等报导了通过人工智能技术从现有文献中筛选出已上市药物Baricitinib是潜在治疗新冠肺炎的药物，该技术利用药物信息知识图谱筛选出6种AAK1抑制剂，并最终建议Baricitinib在COVID-19患者中开展临床试验的候选药物[48]。

总体上，通过干预病毒生命周期主要环节的靶向药物设计的策略，利用药物虚拟筛选并结合人工智能技术辅助药物筛选，有利于寻找有效抑制SARS-CoV-2的候选化合物，可能成为这类小分子药物研发的趋势之一。