VEGF/VEGFR2通路在牙髓血运重建术模型大鼠牙髓血管新生中的作用

王芹 李立恒 王钟华

(河北北方学院附属第一医院口腔科,河北 张家口 075000)

牙髓血运重建术(REPs)为治疗年轻恒牙根尖周病的新方法,该术可刺激根尖周损伤并诱导血液进入根管,促进牙根继续发育〔1〕。近年来,因龋齿或者外伤等原因导致的年轻恒牙牙髓病和根尖周病的发病率逐年上升,REPs诱导血管新生、促进牙髓修复再生、治疗牙髓病和根尖周病的潜在作用越来越受到临床研究的重视〔2〕。但REPs在细胞因子水平的研究少见,其促进牙髓血管再生修复的具体分子生物学机制也不甚明确。血管内皮细胞生长因子(VEGF)是一种促血管生成最强烈的细胞因子,可与VEGF受体(VEGFR)2结合调控相关基因转录表达,参与炎症反应、创伤愈合及组织器官生长发育等过程〔3〕。但VEGF/VEGFR2是否参与调控牙髓血管再生促进牙髓组织修复过程还不明确。本研究通过在根管显微镜下建立大鼠磨牙牙髓血管再生术动物模型,探讨VEGF/VEGFR2的动态表达及定位情况,推测其在牙髓血管再生术后修复中的价值。

1 材料与方法

1.1动物 取雄性SD大鼠25只,体质量250～280 g,鼠龄2～3个月,口腔卫生状况良好,无龋齿及牙周疾病,动物合格证号为SCXK(渝)2017-006。饲养于河北北方学院附属第一医院动物房内。本研究由河北北方学院附属第一医院动物伦理委员审核批准〔审批号:IACUC-01(20160917)〕。

1.2主要试剂与仪器 胰蛋白酶〔货号:abs47047375,爱必信(上海)生物科技有限公司〕;苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(货号:R20570,厂家:上海源叶生物科技有限公司);VEGF(货号:ab69479)、VEGFR(货号:ab39638)、骨桥蛋白(OPN,货号:ab8448)、整合素(αv)β3(货号:ab119365)抗体(美国abcam公司);蛋白电泳仪(型号1658033,美国Bio-Rad公司)。

1.3模型构建与分组 随机将25只大鼠分为正常对照组、根尖周炎组、REPs术后7、14、28 d组,根尖周炎模型建立及REPs参照文献〔4〕进行。将大鼠用戊巴比妥钠麻醉后,仰卧固定,用30 ml/L的饱和过氧化氢液棉球清洁口腔,750 mg/L乙醇消毒双侧磨牙区,取左右两侧下颌第一磨牙放置吸唾管,全程保持无菌操作。在根管显微镜下用高速不锈钢1/4球钻从大鼠下颌第一磨牙的牙合面近中窝向下钻磨开髓,用#6、#8K锉疏通根管,并去除根管内牙髓,生理盐水冲洗根管后取出K锉,建立根尖周炎模型。REPs:在第一磨牙开髓、去髓后,用生理盐水冲洗残留牙髓组织,再用针刺激根尖出血,棉球(无菌)轻压止血,待凝固后将血凝块表面用三氧化物多聚体(MTA)覆盖,并充填流动树脂;术后注意实验动物保暖,待其苏醒后,正常进水进食。正常对照组不做处理。正常对照组及根尖周组于术后28 d取材,REPs各组于术后7、14、28 d取材进行实验。

1.4组织标本采集 麻醉处死大鼠,分离下颌骨,取左侧下颌骨标本置于4%多聚甲醛中固定24 h。右侧下颌骨标本取牙根尖周组织,置于液氮中保存。

1.5CT影像学观察 左侧下颌骨标本固定24 h后置于专用扫描管中,将牙体长轴平行与管长轴放置,调定扫描电压为70 kV,功率30 W,电流429 μA,用显微CT成像系统进行断层扫描15 min获得断面成像,用于后续观察分析。

1.6HE染色观察大鼠第一磨牙牙根尖及牙根尖周组织病理学变化 左侧下颌骨标本做完CT成像后,标本用400 g/L甲酸脱钙处理(可针刺穿透),梯度乙醇脱水、石蜡包埋后,连续切4 μm厚切片,行HE染色,光学显微镜下观察组织病理形态学。

1.7免疫组化染色检测大鼠第一磨牙牙根尖及牙根尖周组织VEGF表达 取1.6中石蜡切片,烤箱烘烤2 h,常规脱蜡、水化、3%过氧化氢灭活、乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修复、5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液封闭后,加入一抗VEGF抗体(1∶500)孵育过夜,室温下与羊抗兔二抗(1∶1 000)孵育2 h后,二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木素复染;封片后于光镜下观察并拍照,Image Pro Plus5.0软件分析VEGF阳性表达的平均光密度值。

1.8各组第一磨牙牙根尖周组织肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β水平检测 取1.4中液氮中保存的部分牙根尖组织,4 ℃下解冻后加生理盐水研磨制备组织匀浆液,离心取上清,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测TNF-α、IL-1β水平。

1.9Western印迹检测牙根尖周组织VEGFR2、OPN、αvβ3蛋白表达 提取牙根尖组织总蛋白,测定蛋白浓度后,电泳分离50 μg蛋白样品并转膜,室温下将膜封闭2 h后,4 ℃冰箱中与一抗VEGFR2(1∶500)、OPN(1∶500)、αvβ3(1∶500)、β-肌动蛋白(actin,1∶2 000)孵育过夜,室温下与羊抗兔二抗(1∶1 000)孵育2 h后,增强化学发光法显影,Image J软件分析蛋白表达量。

1.10统计学处理 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析和SNK-q检验。

2 结 果

2.1各组一般状况 各组试验期间均存活,试验牙周及根尖周外黏膜无明显红肿,牙体均无折裂或充填物脱落情况。

2.2各组牙根尖及牙根尖周组织CT影像学检查结果 正常对照组牙根发育完善,根尖孔闭合;根尖周炎组牙髓腔开放,根管壁薄,根尖孔未闭合呈开放状;REPs术后7 d组牙髓腔较大,根管壁薄;REPs术后14 d组根管壁增粗,牙髓腔缩窄,根尖稍膨大;REPs术后28 d组,根管口闭合,管壁增厚,有新生高密度硬组织形成,见图1。

图1 各组牙根尖及牙根尖周组织CT影像(×100)

2.3各组牙根尖及牙根尖周组织形态变化 正常对照组根管内可见疏松的结缔组织,根尖牙周膜区为致密结缔组织及大量的纤维、血管和细胞分布;根尖周炎组根管内含坏死物质,根尖周炎性细胞浸润明显,根管内未见新生组织形成;REPs术后7 d组根管内有少量不规则矿化基质和致密结缔组织生成,根尖区周围聚集着少量炎症细胞和幼稚的成纤维细胞;REPs术后14 d组根管内有大量不规则矿化基质和致密结缔组织生成,根尖区附近细胞有进入根管的趋势;REPs术后28 d组根管内可见大量内含血管的新生结缔组织,根管壁增厚,根尖部膨大,根尖孔缩小,见图2。

图2 各组牙根尖及牙周膜组织(HE染色,×200)

2.4各组根尖周组织VEGF表达 深棕色为VEGF强阳性表达。正常对照组VEGF在根尖周组织中呈弱阳性表达;根尖周炎组VEGF在根尖孔炎性细胞浸润区呈强阳性表达;REPs术后7 d组VEGF在根尖周增生的成纤维细胞中呈强阳性表达;REPs术后14 d组及28 d组VEGF在根尖周骨组织骨细胞与吸收的陷窝内呈强阳性表达。见图3。与正常组对照相比,其他各组VEGF阳性表达均显著升高;与根尖周炎组相比,REPs术后7、14、28 d组VEGF阳性表达均显著升高;与术后7 d组相比,REPs术后14、28 d组,VEGF阳性表达均显著升高(均P<0.05),见表1。

表1 各组牙根尖及牙根尖周组织VEGF、TNF-α、IL-1β、VEGFR2、OPN、αvβ3表达水平比较

图3 各组根尖周组织VEGF表达(免疫组化,×400)

2.5各组根尖周组织TNF-α、IL-1β水平 与正常对照组相比,根尖周炎组TNF-α、IL-1β水平显著升高;与根尖周炎组相比,REPs术后7、14、28 d组上述指标水平显著降低;与REPs术后7 d组相比,REPs术后14、28 d组上述指标均显著降低;与REPs术后14 d组相比,REPs术后28 d组上述指标均显著降低(均P<0.05),见表1。

2.6各组根尖周组织中VEGFR2、OPN、αvβ3蛋白表达情况 与正常对照组相比,根尖周炎组根尖周组织VEGFR2蛋白表达显著升高,OPN、αvβ3蛋白表达均显著降低(均P<0.05);与根尖周炎组相比,REPs术后7、14、28 d组VEGFR2、OPN、αvβ3蛋白表达均显著增高;与REPs术后7 d组相比,REPs术后14、28 d组上述指标均显著升高(均P<0.05),见表1、图4。

1～5:正常对照组、根尖周炎组、REPs术后7 d组、REPs术后14 d组、REPs术后28 d组

3 讨 论

由于牙根发育不完全、根管壁薄、根尖孔呈敞开状态年轻恒牙易受各种侵害,致使牙髓坏死、牙根发育受限、根尖开放、根部脆弱甚至脱落,严重影响患者咬合功能〔5〕。年轻恒牙的根管治疗一直是牙医工作的难题〔6〕,研究发现,REPs术可通过刺激根尖部出血诱导根尖周干细胞迁移和分化,恢复牙髓活力再生及牙根生长发育〔7〕。研究证实大鼠上颌第一磨牙牙根可在第15天开始发育,25～30 d发育完成〔8〕,而REPs可在28 d左右完成牙周膜的修复〔9〕。本研究随着REPs治疗时间延长,大鼠根管壁逐渐增粗、牙髓腔逐渐缩窄、牙根尖逐渐膨大闭合,根尖周组织炎症细胞逐渐减少,成纤维细胞逐渐增多,根管内矿化基质和致密结缔组织逐渐生成,至术后28 d时根管内有新生结缔组织、血管样结构生成,根尖区附近有骨样细胞沉积,另外根尖周组织TNF-α、IL-1β水平逐渐降低且接近正常值,提示REPs术后大鼠牙周组织炎症水平降低,牙根管逐渐闭合生长,牙髓组织逐渐修复,与研究〔10〕REPs术后人类年轻恒牙放射影像学研究一致,证实REPs可用于恒牙根尖周病的治疗,但其治疗的分子机制还不甚明确。

血管生成是促进伤口愈合的关键步骤,也是牙齿修复过程中牙髓血管生成的前提条件〔11〕。研究证实,在牙髓损伤修复过程,牙本质基质释放VEGF,形成牙本质-牙髓复合体,促进牙髓再生〔12〕。牙髓修复过程中的VEGF可能来源于根尖周组织中的间充质干细胞〔13,14〕,提示VEGF可能在牙髓血管生成修复过程中起重要作用。本研究提示,REPs术促进牙根生长及牙髓再生的作用可能与促进根尖周组织中VEGF表达有关。

VEGF主要通过受体VEGFR2进行传导并调控血管生成及细胞的增殖迁移,研究证实,VEGF-VEGFR2可通过局部黏着斑激酶(FAK)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路调控人牙髓干细胞迁移,促进炎症牙髓组织的修复〔15〕。张映娟等〔9〕发现,无髓年轻恒牙REPs术后在牙根管及根尖内检测到骨组织沉积及根尖闭合趋势,提示REPs术促进牙根闭合及牙根生长的作用,也可能与促进牙髓干细胞骨组织沉积有关。史欣等〔16〕发现,OPN诱导液可促进牙髓干细胞向成骨分化,证实OPN在骨矿化、代谢及重建过程中发挥重要作用。另外,OPN除是成骨分化诱导因子外,还是一种黏附因子〔17〕,研究证实,OPN不仅可通过αvβ3受体介导细胞黏附,形成酸性环境,促进细胞移行和扩散〔18〕,还可通过VEGF促进血管生成〔19〕。αvβ3也可介导破骨细胞与纤维蛋白结合,参与血管内皮细胞黏附、破骨细胞分化、成熟过程,促进破骨细胞通过血管系统在骨组织聚集〔20〕。本研究推测,根尖周组织具有成骨分化及迁移的因子作用较弱可能是恒牙牙根停止发育的关键因素。本研究表明REPs术可通过激活VEGF/VEGFR2通路,促进牙根尖周组织及牙髓组织血管再生,上调OPN、αvβ3蛋白表达,诱导成骨分化及迁移,促进牙根生长及牙髓再生。

本研究为阐明REPs促进牙根生长及牙髓再生的分子机制提供一定参考,但VEGF/VEGFR2信号通路靶分子较多,牙髓再生及牙根生长的分子机制复杂多样,REPs术后牙髓再生及牙根生长的机制,有待进一步验证。