CHIP介导的OGG1在老年性白内障发展过程中作用

唐静 阳帆 周丽丽 袁小波

(湘潭市第一人民医院 1医学转化中心,湖南 湘潭 411100;2营养科;3湖南交通工程学院护理学院)

老年性白内障是主要致盲性疾病之一,随着老年人口的快速增加,白内障患病率进一步提升,在降低患者生存质量的同时加重了社会医疗负担〔1〕。由于老年性白内障的病因尚未阐明,导致药物疗效不佳,临床治疗仍以手术为主〔2〕。研究发现,晶状体蛋白质变性会影响正常的折射功能,引发不同程度的晶状体混浊〔3〕。泛素化是蛋白质翻译后修饰的主要方式,其中E3连接酶与底物蛋白的特异性密切相关,因此在调控泛素化过程中的作用最明显〔4,5〕。相关研究已证实,老龄大鼠晶状体上皮细胞中存在DNA损伤和DNA修复酶活性下降,提示DNA氧化损伤及修复障碍可能参与老年性白内障的发生与发展〔6〕。研究报道显示,8-氧代鸟嘌呤-DNA糖基化酶(OGG)1参与晶状体上皮细胞的DNA修复过程,在白内障病情发展中起关键作用〔7〕。但关于OGG1蛋白翻译后修饰的研究仍十分少见。本研究探讨热休克蛋白70羰基末端反应蛋白(CHIP)介导的OGG1在老年性白内障发展中的作用。

1 材料与方法

1.1材料 SRA01/04永生化人晶状体上皮细胞株购于上海弘顺生物有限公司;RPMI1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购于百草泰克(北京)生物科技有限公司;手持中波紫外线检测灯购于苏州圣光仪器有限公司;CHIP蛋白过表达质粒由北京博云华康基因科技有限公司设计合成;兔抗人CHIP单克隆抗体,鼠抗人OGG1单克隆抗体,鼠抗人β-actin单克隆抗体,辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG均购于铭修(上海)生物科技有限公司。

1.2细胞培养及氧化损伤模型建立 将SRA01/04永生化人晶状体上皮细胞取出,放入37 ℃恒温水浴箱中解冻,之后2 000 r/min离心15 min,离心半径10 cm,将上清液弃去,加入新鲜的RPMI1640完全培养基(含10%胎牛血清、10 g/L青链霉素),接种到细胞培养瓶中,在37 ℃ 5%CO2的培养箱中继续孵育,每24～48 h换液,显微镜下观察细胞密度超过80%时,使用Hanks平衡盐溶液洗涤细胞,加入磷酸缓冲液,用手持中波紫外线检测灯在30 cm处照射。将细胞分为对照组和模型组,根据照射时间将模型组进一步分成5个亚组(0、10、20、30、40 min),中波紫外线照射时间结束后,更换新鲜的RPMI1640完全培养基继续培养24 h。

1.3细胞转染与分组 将SRA01/04永生化人晶状体上皮细胞接种到6孔板中,37 ℃ 5%CO2培养箱中培养,显微镜下观察细胞密度超过70%时进行实验。分为空白对照组、空载体质粒转染组、CHIP过表达质粒转染组,培养孔中加入试剂体积为VOpti-MEM∶V脂质体3000∶Vp3000=250 μl∶70 μl∶10 μl,之后再加入转染质粒3 μg混合均匀,室温条件下静置20 min。放入37 ℃ 5%CO2的培养箱中孵育6 h,之后更换为RPMI1640完全培养基(含10%胎牛血清、10 g/L青链霉素)继续孵育72 h。再建立细胞氧化损伤模型,设为细胞氧化损伤模型组。

1.4免疫沉淀实验 向细胞培养液中加入免疫沉淀裂解液(20 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐,100 mmol/L氯化钠溶液,1% Triton X-100溶液),分离蛋白质上清液。免疫沉淀实验分组如下:IgG组、OGG1组、CHIP组,使用OGG1抗体沉淀下与OGG1抗体结合的蛋白,使用CHIP抗体沉淀下与CHIP抗体结合的蛋白;每组取500 μg蛋白,加入1 μl相对应的抗体后放于摇床上过夜。次日使用磁力架提取抗体蛋白复合物,进行Western印迹实验;同时从未经免疫沉淀实验处理的细胞总蛋白组中取40 μl蛋白原液检测内源性蛋白表达。

1.5Western印迹检测OGG1、CHIP蛋白表达 将细胞放于冰上,磷酸缓冲液充分洗涤后加入RIPA细胞裂解液200 μl,冰上裂解提取细胞总蛋白,使用二喹啉甲酸(BCA)试剂盒测定蛋白的上样量,行10%十二烷基硫酸钠 (SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离蛋白,电泳参数为80 V、120 min;电转法将目标蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,用封闭液在室温条件下封闭2 h。按照抗体说明书配制一抗稀释液并滴加:兔抗人CHIP单克隆抗体(稀释度:1∶1 000),鼠抗人OGG1单克隆抗体(稀释度:1∶400),鼠抗人β-actin单克隆抗体(稀释度:1∶2 000),放入4 ℃冰箱中过夜。次日加入HRP标记的山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG,均为1∶5 000稀释,室温孵育2 h,洗涤后显影,记录各条带的灰度值。

1.6统计学分析 采用SPSS24.0软件,实验数据均符合正态分布,多组间比较行方差分析,两两比较行LSD-t检验。

2 结 果

2.1晶状体上皮细胞中OGG1蛋白的泛素化修饰及E3泛素连接酶的预测 免疫沉淀实验结果显示,晶状体上皮细胞中存在OGG1蛋白的泛素化修饰;使用人类泛素连接酶与底物相互作用的预测和展示系统UbiBrowser分析显示,CHIP可能是引发OGG1泛素化修饰的E3泛素连接酶。 Western印迹检测结果显示,CHIP能够与OGG1相互结合,提示OGG1可能参与OGG1蛋白的泛素化修饰过程。见图1。

图1 Western印迹检测CHIP与OGG1的相互作用

2.2不同中波紫外线照射时间晶状体上皮细胞中CHIP蛋白表达 与中波紫外照射0 min(1.04±0.02)相比,10、20、30、40 min CHIP蛋白质相对表达量分别为0.82±0.06、1.37±0.10、1.85±0.08、2.64±0.15,差异均有统计学意义(P<0.05)。10 min时,CHIP蛋白相对表达量明显低于其他中波紫外线照射时间,20～40 min时,随着照射时间增加,CHIP蛋白相对表达量逐渐增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 不同中波紫外线照射时间晶状体上皮细胞中CHIP蛋白表达

2.3CHIP蛋白过表达模型验证 CHIP过表达质粒转染组晶状体上皮细胞中CHIP蛋白相对表达量(1.48±0.03)明显高于细胞氧化损伤模型组(0.95±0.01)和空载体质粒转染组(0.93±0.01)和空白对照组(0.96±0.01,P<0.05);CHIP蛋白相对表达量在空载体质粒转染组与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

1～4:空白对照组、细胞氧化损伤模型组、空载体质粒转染组、CHIP过表达质粒转染组;下图同

2.4各组OGG1蛋白表达水平比较 与空白对照组(1.04±0.03)相比,细胞氧化损伤模型组OGG1蛋白相对表达量(4.76±0.27)明显升高(P<0.01);CHIP过表达质粒转染组(3.58±0.24)明显低于细胞氧化损伤模型组和空载体质粒转染组(4.92±0.30,P<0.05);细胞氧化损伤模型组与+空载体质粒转染组OGG1蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

图4 各组晶状体上皮细胞中OGG1蛋白表达

3 讨 论

老年性白内障的发生、发展受中波紫外线照射、氧化损伤等多种因素影响〔8〕。研究显示,中波紫外线照射是老年性白内障发展过程中的主要环境因素〔9〕。晶状体上皮细胞通过吸收大量中波紫外线引发一系列分子改变,包括DNA氧化损伤、细胞周期改变及泛素化等蛋白质翻译后修饰等,破坏了晶状体上皮细胞中功能蛋白质的稳定性,导致蛋白质的错误折叠〔10〕。研究报道显示,在神经退行性病变等年龄相关性疾病的发生与发展过程中,中波紫外线照射、自由基等氧化应激状态均会引发DNA损伤修复信号通路相关因子无法被泛素化及时降解,抑制对受损DNA的修复〔11〕;同时上述因子还会引发蛋白毒性,干扰细胞的正常生理过程。泛素蛋白酶系统包括底物蛋白泛素化、泛素标记蛋白降解两个过程,是真核细胞清除错误折叠蛋白的主要手段之一〔12〕。泛素蛋白酶体系统包括E1、E2、E3及去泛素化酶和蛋白酶,形成过程主要包括:在腺嘌呤核苷三磷酸供能的基础上,E1与泛素C端的残基特异性结合后激活泛素,之后E1转移到E2生成中间产物,E2与不同类型的E3共同形成泛素化修饰〔13〕。在上述过程中,E3能够识别底物蛋白并聚集E2,在蛋白质泛素化修饰调控过程中发挥重要作用。

CHIP属于胞质蛋白,具有E3泛素连接酶活性,可经泛素蛋白酶途径促使CHIP底物发生泛素化修饰,包括氨基端TRR区、羧基端U-box区、中间功能区3个功能域,维持人体正常蛋白水平,降解突变蛋白或错误折叠蛋白,在维持细胞正常功能中发挥重要作用〔14〕。本研究说明CHIP可能参与调控晶状体上皮细胞的氧化损伤过程。

研究发现,CHIP通过靶向降解P21、P57等DNA损伤修复蛋白,影响细胞周期过程,抑制恶性肿瘤的发生与发展〔15〕。亦有研究发现,OGG1是DNA碱基切除修复过程中的重要调控蛋白〔16〕。本研究确定CHIP能够与OGG1相互结合,提示OGG1可能参与OGG1蛋白的泛素化修饰过程,并提示氧化损伤早期晶状体上皮细胞中CHIP高表达,OGG1蛋白表达下调,抑制损伤DNA的修复,促进老年性白内障的发生与发展。