胃癌组织内miR-34a与miR-27b表达及其抑制胃癌生长与血管生成的机制

杨向超 李昌伟 周晓华 李合

(海南医学院第一附属医院普通外科,海南 海口 570102)

近年来,随着卫生和饮食习惯的改善,胃癌的发病率已逐渐降低,但该疾病仍是全球第五大常见的癌症类型,每年有100万以上的新病例出现且导致78万例患者发生死亡〔1〕。胃癌的高死亡率主要归因于缺乏精确的早期诊断标准及无效治疗〔2〕。目前,手术治疗、免疫治疗和靶向治疗是胃癌治疗的主要手段,然而,多数患者在进行手术治疗生存率和预后不佳。而肿瘤细胞获得性或原发性耐药的产生也使得多数接受化疗的患者预后很差〔3〕。

近年来,微小RNA(miRNA)已成为用于癌症或其他疾病诊断研究的重点内容。miRNA在体液中稳定存在,能够被外泌体所覆盖,因此不会被内源性RNA降解酶(RNase)所破坏〔4〕。miRNA是长度为19～25个核苷酸的非编码单链小RNA,其主要功能是抑制或促进细胞内特异性基因的表达,进而调节细胞的增殖、侵袭和迁移等过程。miR-34a位于人类染色体抑癌区域1p36.23,其表达受到P53信号通路调节;miR-27b则是位于C9orf3基因第14个内含子,以往研究表明,miR-34a和miR-27b参与了多种肿瘤发生发展的关键环节,包括细胞周期、分化、转移及黏附等〔5～8〕。血管内皮生长因子(VEGF)是缺氧诱导的促血管生成因子,其受体包括VEGFR-1/2/3,属于受体酪氨酸激酶,主要分布在内皮细胞、骨髓源细胞和神经元细胞膜中。其中,VEGFR-2几乎介导所有的VEGF诱导血管生成作用,在血管生成过程中,磷酸化的VEGFR2启动下游信号传导级联反应,涉及细胞存活、生长和迁移等多个细胞过程〔9,10〕。本研究检测胃癌组织及癌旁组织中miR-34a、miR-27b的表达,通过体介导法过表达两个miRNA观察胃癌细胞增殖、迁移、侵袭及血管生成的变化情况,并初步探索其在胃癌生长和转移中的分子机制。

1 材料与方法

1.1临床资料收集 收集15例胃癌组织及距癌组织边缘5 cm以上的癌旁组织,均为海南医学院第一附属医院2018年12月至2020年6月胃癌手术切除标本,其中男11例,女4例,年龄25～72岁,平均(48.0±4.45)岁。大体分型为:溃疡型4例,浸润溃疡型7例、弥漫浸润型4例;分化程度为:低分化8例、中分化4例、高分化3例;TNM分期为:Ⅰ级2例、Ⅱ级5例、Ⅲ级7例、Ⅳ级1例。患者术前均未接受化疗及放疗,且临床资料完整,未有合并其他肿瘤者。所有病例标本由2位专业病理科大夫诊断,患者及家属均签署知情同意书,本研究获得医院伦理委员会批准。

1.2主要试剂与材料 人胃癌细胞株SGC-7901购自中国科学院上海细胞库。RPMI1640培养基、胎牛血清、青霉素和链霉素及胰蛋白酶均购自美国Gibco公司,Trizol试剂盒购自南京诺维赞生物公司,miRNA逆转录试剂盒和实时荧光定量 qPCR试剂盒购自Genecopoeia公司,免疫组织化学染色试剂盒购自武汉博士德生物公司,Lipofectamine3000转染试剂盒购自美国Promega公司,CCK-8和EdU试剂盒购自杭州四季青公司,Transwell小室购自康宁公司,VEGF与VEGFR2酶联免疫试剂盒购自南京凯基生物公司,双荧光素酶试剂盒、基质胶胶、二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒和电化学发光(ECL)液购自上海碧云天生物研究所,兔抗人VEGF,兔抗人KDR、兔抗人FLK-1购自英国Abcam公司,鼠抗人β-actin和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔购自上海昊鑫生物公司,野生型(WT-VEGF 3′-UTR)和突变型(MUT-VEGF 3′-UTR)VEGF 3′-UTR质粒载体及引物序列均由上海生工生物工程公司构建合成。

1.3方法

1.3.1胃癌组织及癌旁组织miR-34a、miR-27b的检测 使用Trizol试剂从研磨破碎的胃癌组织及癌旁组织中抽提总RNA,紫外分光光度计检测RNA纯度与浓度,OD260/OD280值的范围在1.8～2.0即为合理。根据 TaqMan® miRNA Reverse Transcription Kit将总RNA进行反转录获取cDNA,接着利用TaqMan MiRNA Assays试剂盒进行实时荧光定量PCR实验检测各样本组织中miR-23a和miR-27b的表达水平变化,以U6作为内参。反应条件为:95 ℃,10 min;95 ℃,15 s;60 ℃,60 s;扩增40次。实验重复3次,扩增结束后,根据2-ΔΔCt法来计算miRNA的相对表达水平。具体引物序列:miR-34a上游引物:5′-GCCGCGGGGTTCCTGGGGAT-3′,下游:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;miR-27b上游引物:5′-GGGGTTCACAGTGGCTAAG-3′;下游:5′-CAG TGCGTGTCGTGGAGT-3′;U6上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游:5′-AACGCTTCAGAATTTGCGT-3′;序列均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.2胃癌组织及癌旁组织中VEGF表达的检测 通过免疫组织化学染色方法检测胃癌组织标本及癌旁组织标本VEGF表达。将组织固定好后,制备石蜡切片,脱蜡至水,0.3%过氧化氢(H2O2)室温孵育30 min,抗原高温微波热修复,10%山羊血清封闭非特异性位点,室温孵育1 h,滴加兔抗VEGF(1∶200)一抗工作液,4 ℃孵育过夜。次日,滴加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素工作液(1∶1 000),室温孵育1 h,滴加二氨基联苯胺(DAB)染色,苏木素复染细胞核,二甲苯透明,封片,所有操作严格按照说明书进行。结果判断:VEGF蛋白阳性表达定位于细胞膜或细胞质内,呈棕黄色。通过光学显微镜在低倍镜(40倍)下选取细胞密集区域,随机选取5个高倍视野(400倍)计数100个细胞,计算阳性细胞占总细胞的百分率。

1.3.3细胞分组与转染 取对数生长期的SGC-7901细胞接种于12孔板内,每孔细胞数为1×105个,放在37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养,待细胞融合度达到80%以上,进行转染实验。实验具体分组:①空白对照A组、miR-34a mimic组、miR-34a NC组;②空白对照B组、miR-27b mimic组、miR-27b NC组。将Lipofectamine3000分别与50 nmol/L miR-34a mimic、50 nmol/L miR-27b mimic及50 nmol/L对应的阴性对照转染至SGC-7901细胞中,操作严格按照试剂盒说明书进行,置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱转染6 h 后,更换新鲜培养基,继续培养48 h后用于后续实验。为保证转染效果,转染每2 d执行1次。

1.3.4CCK-8法检测细胞增殖活性 SGC-7901细胞转染后置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱内培养,分别于培养24、48、72 h时,每孔加入10 μl CCK-8试剂液,混匀后继续置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱继续培养2 h,使用酶联免疫检测仪测定450 nm处吸光度值,实验重复3次。

1.3.5EdU实验检测细胞增殖水平 SGC-7901细胞转染后按1×105个/孔的密度接种在24孔板,置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱培养24 h,随后更换终浓度为10 μmol/L EdU的培养基培养,继续培养2 h后弃培养基,PBS洗涤细胞,滴加4%多聚甲醛室温固定20 min,弃固定液,加入甘氨酸孵育5 min,PBS洗涤后,使用0.5% Triton X-100穿透细胞膜10 min,PBS洗涤细胞,再加入Apollo567荧光染料室温避光染色30 min,甲醇清洗细胞,接着加入Hoechst33342反应液,室温避光孵育30 min,弃反应液,PBS清洗细胞后,甘油封片,利用激光共聚焦显微镜观察细胞染色情况,其中蓝色荧光为细胞核,红色荧光为EdU阳性细胞。

1.3.6Transwell实验检测细胞迁移与侵袭 在24孔Transwell小室上室加入50 μl稀释的基质胶,置于37 ℃待胶凝固。将转染的SGC-7901细胞密度调整为2×104个/ml,吸取200 μl悬液加入Transwell 小室上室,下室加入600 μl含10%胎牛血清新鲜培养液,置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养24 h,培养结束后取出小室,弃培养液并擦去上室细胞,在小室中加入4%多聚甲醛固定30 min,0.1%结晶紫染色,PBS清洗多余染液,光学显微镜下观察拍摄图像,随机选择5个视野计数,计算细胞侵袭数目,结果取平均值。迁移实验除不铺基质胶外,其他步骤均与上述侵袭实验相同。

1.3.7酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清液VEGF、VEGFR2水平 SGC-7901细胞转染后培养48 h,收集细胞上清,以4 000 r/min离心5 min,吸取等量的上清于离心管。按照VEGF与VEGFR2的酶联免疫试剂盒说明书检测细胞上清中VEGF、VEGFR2的浓度,操作严格按照试剂盒说明书步骤执行。

1.3.8荧光素酶报告系统检测miR-34a、miR-27b与VEGF的靶标关系 通过生物信息学工具TargetScan7软件,并参考VEGF 3′-UTR序列,预测miR-34a、miR-27b与VEGF 3′-UTR结合的靶位点序列,设计并合成野生型(WT-VEGF 3′-UTR)和突变型(MUT-VEGF 3′-UTR)VEGF的3′-UTR质粒载体。将对数生长期的SGC-7901细胞以1×105个/孔的密度接种于24孔板中培养,使用 Lipofactamine3000分别将miR-34a mimic、miR-27b mimic或对应的阴性对照联合构建好的WT-VEGF 3′-UTR 质粒载体或MUT-VEGF 3′-UTR质粒载体转染到SGC-7901细胞,置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h 后,PBS冲洗细胞,加入裂解液裂解细胞,根据双荧光素酶试剂盒操作说明书,检测各组细胞的荧光素酶活性。

1.3.9Western印迹检测细胞中KDR、FLK-1蛋白表达 收集转染后SGC-7901细胞,PBS清洗后加入RIPA裂解缓冲液提取总蛋白,通过BCA法测定蛋白质含量。取等量各组蛋白样品30 μg加样,10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质,电转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脱脂奶粉中室温封闭2 h,TBST洗膜,接着加入兔抗KDR(1∶300)、FLK-1(1∶300)一抗工作液,以鼠抗β-actin作为内参蛋白(1∶5 000),4 ℃下孵育过夜;次日,弃一抗工作液,TBST洗膜,加入对应辣根过氧化物酶标记的二抗工作液(1∶5 000),室温孵育1 h,TBST洗膜,ECL液显色3 min,凝胶成像系统拍照,Image Pro-Plus系统分析各蛋白条带的灰度值,计算各蛋白的相对表达水平。

1.3.10静脉内皮细胞的成管实验 将稀释后的基质胶加入24孔板中,置于37 ℃孵育1 h,待胶凝固形成基质膜。取对数生长期的HUVECs,消化后,将浓度调整为5×106个/ml,取200 μl细胞悬液接种于铺好基质胶的24孔板,分别加入转染后培养48 h的SGC-7901细胞上清液培养,置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养48 h,终止培养,在倒置显微镜下观察HUVECs成管情况。

1.4统计学分析 采用SPSS23.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1胃癌组织及癌旁组织miR-34a、miR-27b表达比较 胃癌组织中miR-34a(1.00±0.05)与miR-27b的相对表达水平(1.00±0.06)均显著低于癌旁组织中的表达水平(3.02±0.31,3.11±0.34),差异具有统计学意义(t=38.524、26.981,均P=0.000)。

2.2胃癌组织及癌旁组织VEGF表达比较 免疫组织化学染色结果可见,胃癌肿瘤组织细胞胞质内出现棕黄色染色,癌旁组织内染色较浅,细胞着色较少,胃癌组织VEGF阳性表达率显著高于癌旁组织VEGF阳性表达率〔(38.0±4.2)% vs (11.3±0.89)%;t=34.152,P<0.01〕,见图1。

图1 免疫组织化学染色检测胃癌组织及癌旁组织VEGF表达(×400)

2.3转染后SGC-7901细胞miR-34a、miR-27b表达比较 与空白对照A组(1.00±0.09)比较,miR-34a mimic组细胞miR-34a相对表达水平(3.1±0.43)显著升高(P<0.01),miR-34a NC组细胞miR-34a表达(1.06±0.09)变化无统计学差异(P>0.05)。与空白对照B组(1.00±0.06)比较,miR-27b mimic组细胞miR-27b相对表达水平(2.4±0.34)显著升高(P<0.01),而miR-27b NC组(1.00±0.08)变化无统计学差异(P>0.05)。

2.4转染后SGC-7901细胞增殖比较 在转染48 h和72 h后,miR-34a mimic组SGC-7901细胞活性较空白对照A组显著下降(P<0.01),miR-34a NC组与空白对照A组细胞活性之间的差异无统计学意义(P>0.05)。miR-27b mimic组细胞活性较空白对照B组也显著下降(P<0.01),miR-27b NC组与空白对照B组之间的变化无统计学意义(P>0.05),见表1。miR-34a mimic组〔(43.46±2.23)%〕细胞活性较空白对照A组〔(81.38±4.6)%〕显著下降(P<0.01),miR-34a NC组〔(79.36±4.6)%〕与空白对照A组细胞活性之间的差异无统计学意义(P>0.05)。与空白对照B组〔(62.1±4.5)%〕比较,miR-27b mimic组细胞活性〔(24.86±2.1)%〕显著下降(P<0.01),而miR-27b NC组(59.36±4.6%)变化无统计学差异(P>0.05),见图2。

表1 各组细胞增殖、迁移与侵袭及SGC-7901细胞上清液中VEGF与VEGFR2含量比较

图2 各组细胞增殖活性(EdU染色,×100)

2.5转染后SGC-7901细胞迁移与侵袭比较 与空白对照A组比较,miR-34a mimic组细胞迁移与侵袭数目均显著减少(P<0.01),miR-34a NC组细胞迁移与侵袭数目变化无统计学意义(P>0.05)。与空白对照B组比较,miR-27b mimic组细胞迁移与侵袭数目均显著减少(P<0.01),miR-27b NC组与空白对照B组细胞的迁移与侵袭数目无统计学差异(P>0.05),见表1、图3。

图3 Transwell实验检测细胞迁移与侵袭(结晶紫染色,×100)

2.6转染后细胞上清液VEGF、VEGFR2水平比较与空白对照A组比较,miR-34a mimic组细胞上清液中VEGF与VEGFR2含量均显著降低(P<0.01),miR-34a NC组细胞上清液中VEGF与VEGFR2含量较空白对照A组的变化无统计学意义(P>0.05);与空白对照B组比较,miR-27b mimic组细胞上清液中VEGF与VEGFR2含量也均显著降低(P<0.01),miR-27b NC组细胞上清液中VEGF与VEGFR2含量较空白对照B组的变化无统计学意义(P>0.05),见表1。

2.7miR-34a、miR-27b靶向VEGF关系验证 通过TargetScan7预测发现,miR-34a、miR-27b均与VEGF 3′-UTR在特定区域存在碱基互补现象,见图4。双荧光素酶报告实验结果显示,与miR-34a NC和WT-VEGF 3′-UTR重组质粒共转染组比较,miR-34a mimic和WT-VEGF 3′-UTR重组质粒共转染组的相对荧光值显著降低(P<0.01);同样,miR-27b mimic和WT-VEGF 3′-UTR重组质粒共转染组的相对荧光值较miR-27b NC和WT-VEGF 3′-UTR重组质粒共转染组显著降低(P<0.01),见表2。

表2 各组SGC-7901细胞相对荧光值比较

图4 miR-34a、miR-27b与VEGF 3′-UTR靶向结合位点

2.8转染后细胞KDR/FLK-1蛋白表达比较 miR-34a mimic组SGC-7901细胞中KDR、FLK-1蛋白表达较空白对照A组中显著降低(P<0.01),miR-34a NC组与空白对照A组的KDR、FLK-1蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。miR-27b mimic组细胞中KDR、FLK-1蛋白表达较空白对照B组中显著降低(P<0.01),miR-27b NC组与空白对照B组中两种蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05),见图5、表3。

表3 Western印迹检测细胞中KDR、FLK-1蛋白表达

1～6:空白对照A组、miR-34a NC组、miR-34a mimic组、空白对照B组、miR-27b NC组、miR-27b mimic组

2.9各处理组静脉内皮细胞的成管结果比较 与空白对照A组〔(36.38±4.73)个〕比较,miR-34a mimic组细胞形成小管数目〔(17.46±1.84)个〕显著减少(P<0.01),miR-34a NC组细胞小管数目〔(35.17±6.16)个〕无统计学差异(P>0.05)。miR-27b mimic组中细胞形成小管数目〔(9.87±1.35)个〕较空白对照B组〔(29.10±3.95)个〕显著减少(P<0.01),miR-34a NC组〔(30.13±4.68)个〕与空白对照B组的细胞小管数目之间无统计学差异(P>0.05),见图6。

图6 各组静脉内皮细胞成管情况(×100)

3 讨 论

胃癌的病理过程涉及各种基因、因子和信号途径参与,遗传变异导致正常细胞的结构和功能发生不可逆转的变化,最终导致癌变发生。胃癌发展有多个步骤,且这些步骤已通过病理和流行病学研究确定,在大多数情况下,最初阶段是慢性胃炎,其次发展为胃萎缩和胃黏膜肠化生细胞变性,最终发展为胃癌〔2〕。基因遗传、吸烟、饮酒和不良饮食习惯均可能引发胃癌。目前,病理学诊断、物理学诊断和血清学检查是常规的癌症诊断方法〔11〕,随着医疗技术的进步,出现了以细胞变化为中心的基因诊断方法,旨在早期检测出从正常表型细胞转化为癌细胞的证据。

目前,miRNA已成为一类新型潜在生物标志物用于微创诊断和疾病监测中。miR-34a和miR-27b是多种肿瘤进展的独立预测因子。miR-34a表达水平与肝癌、乳腺癌、结直肠癌、膀胱癌的恶性程度呈负相关,miR-34a下调后削减了P53介导的促进细胞凋亡作用。此外,miR-34a还可以通过靶向相关分子来影响癌细胞的增殖和侵袭,例如Shen等〔12〕不仅证明了miR-34a在喉鳞状细胞癌中的低表达,而且发现转染miR-34a mimic可以通过靶向下调survivin蛋白显著抑制细胞的增殖,使细胞发生G0/G1阶段阻滞;Geng等〔13〕研究发现,过表达miR-34a可通过靶向调节E2F3和存活素(survivin)的表达来降低人乳头瘤病毒阳性宫颈癌细胞的生存能力和转移能力。miR-27b也在多种癌症类型中起着复杂的作用,调节一系列生物学过程;Zhang等〔14〕研究发现miR-27b在非小细胞肺癌中表达水平降低,通过靶向锌指转录因子(Snail)1发挥抑癌作用,以抑制肺癌的生长和上皮间质转化。已有研究表明,miR-27b在胃癌组织和细胞中均下调,而TNM分期较高且肿瘤较大的患者组织中miR-27b表达水平较低,miR-27b能够通过靶向核受体亚家族2F组成员(NR2F)2抑制胃癌转移〔15〕。本研究结果同样显示,miR-34a与miR-27b在胃癌组织中呈低表达,通过转染mimic在胃癌细胞中过表达miR-34a与miR-27b后可显著抑制肿瘤细胞增殖与转移。由此进一步表明,miR-34a与miR-27b可能在胃癌进程中起着抑癌基因的作用。

胃癌组织中强大的血管生成能力显著促进了肿瘤的生长与转移过程,这也是胃癌具有高死亡率的重要原因之一,鉴定胃癌血管生成的分子机制并研发新的抗血管生成靶标药物对于患者来说意义重大。

研究表明,肿瘤细胞中VEGF与其受体VEGFR2结合后会激活酪氨酸激酶,促进受体磷酸化和相关信号转导机制来刺激血管生成,从而增强组织中的血管生长并维持血液供应〔9,16〕。肿瘤细胞分泌的VEGF以旁分泌的方式通过与内皮细胞上VEGFR相互作用而刺激血管生成。然而,源自肿瘤细胞的VEGF也起自分泌因子的作用以调节细胞一系列生物学行为〔17〕。

本研究结果显示,VEGF在胃癌组织中高表达,而在胃癌细胞中转染miR-34a mimic或miR-27b mimic后,细胞上清液中VEGF与VEGFR2含量降低。结合生物信息学软件预测和双荧光素酶报告分析得到miR-34a与miR-27b靶向调控VEGF表达。目前,已发现多个miRNA通过靶向VEGF发挥作用,例如:miR-101通过抑制环氧化物酶(COX)-2衍生的前列腺素(PG)E2信号传导靶向VEGF来抑制胆管癌的血管生成〔18〕;miR-182-5p通过靶向VEGF并抑制细胞外信号调节激酶(ERK)和蛋白激酶B(AKT)信号通路,以此调节血管生成和淋巴管生成来抑制结肠癌肿瘤的生长〔19〕。本研究结果显示,转染miR-34a mimic或miR-27b mimic的细胞中KDR、FLK-1蛋白表达水平降低,HUVECs细胞形成小管数目减少。由此推测,miR-34a 与miR-27b通过靶向VEGF/VEGFR2轴来发挥抑制血管生成的作用。

综上所述,miR-34a与miR-27b在胃癌组织中低表达,两者能够抑制胃癌细胞的增殖、迁移与侵袭,并且具有抑制血管内皮细胞小管形成的能力。VEGF是miR-34a与miR-27b的共同靶标基因,miR-34a与miR-27b可能通过调控VEGF/VEGFR2轴发挥相关抑制作用。miR-34a与miR-27b可能为胃癌潜在的治疗靶点,本研究为以后该疾病的诊治研究提供新的切入点。