蛋白质翻译后修饰在禁食低代谢调节中的研究进展

隋修锟 吴 峰 张洪玉 马 婷 戴钟铨 李莹辉

(1.哈尔滨工业大学(深圳)电子与信息工程学院, 深圳 518055; 2.中国航天员科研训练中心航天医学基础与应用国家重点实验室, 北京 100094; 3.深圳市绿航星际太空科技研究院, 深圳 518003)

1 引言

低代谢调节技术在载人深空探索和极端环境生存中具有广泛的应用前景。 目前,美国、俄罗斯和欧盟等都在布局低代谢调节技术概念研究和应用策略探索。 在长期载人星际飞行期间让航天员大部分时间处于低代谢状态,将极大降低飞行载荷、减缓航天员心理压力和人际关系矛盾,保证星际飞行更加安全[1]。 在特殊环境条件下,机体处于低代谢状态可进一步激发自身潜能,通过体内能量代谢调节维持低代谢水平,进而更好地应对极端环境所带来的负面影响。

禁食低代谢是机体在主动性限制饮食模式下,通过不断的生理调整将能量需求降至最低,并通过系统性能量底物转换达到新稳态[1]。 大量研究表明,科学禁食能促进机体新陈代谢,激发机体代谢转换,有助于逆转衰老[2-3]。 禁食低代谢模式被认为是一种现阶段技术可行、安全有效的空间低代谢模式。 然而,禁食低代谢过程中机体能量代谢调控极其复杂,使得现有禁食低代谢技术存在诱导效率较低的问题,亟需探索全面、快速、高效的禁食低代谢诱导方式;而阐明在代谢活性调节起至关重要作用的转录因子、限速酶等调节因子的转录表达和翻译后修饰则是提高禁食低代谢诱导效率的关键途径[4-6]。

蛋白翻译后修饰是在蛋白的某些氨基酸残基上共价结合化学小分子基团的过程,进而调节蛋白功能[7],具有调节速度快、且能量需求更低的特点[8]。 因此,该方式被认为是维持禁食低代谢机体能量代谢新平衡的一种潜在调控机制。 目前,已有超过400 多种蛋白质翻译后修饰方式被发现,了解这些蛋白质翻译后修饰方式的特点及其调控作用,对于探索高效的禁食低代谢诱导模式具有重要价值。

本文对不同蛋白翻译后修饰在禁食低代谢过程中肝脏糖、脂能量代谢调控中的作用进行综述,并对在未来载人航天中的应用前景进行展望。

2 磷酸化修饰与禁食肝脏能量代谢

蛋白质磷酸化修饰(Phosphorylation)是指蛋白质在磷酸化激酶的催化下把腺苷三磷酸(Adenosine Triphosphate, ATP) 或三磷酸鸟苷(Guanosine Triphosphate, GTP)上的磷酸基转移到特定氨基酸残基(Ser、Tyr、Thr)上的过程[9]。磷酸化修饰对蛋白质功能具有重要的调节作用,被称为蛋白质功能的开关[10]。

2.1 磷酸化修饰调控转录因子的活化

糖异生途径是禁食期间肝脏葡萄糖的主要来源,多种转录因子参与禁食期间糖异生途径转录调控[11]。 在禁食状态下,体液中循环的胰高血糖素含量增加,导致腺苷酸环化酶的激活和环磷酸腺苷(Cyclic Adenosine Monophosphate, cAMP)的形成,细胞内cAMP 水平的增加激活了蛋白激酶A(Protein Kinase A, PKA),使转录因子cAMP 反应元件结合蛋白(cAMP-response Element Binding Protein, CREB)激活并使其磷酸化,促进CREB结合并启动下游糖异生基因,增加肝脏葡萄糖的输出[12]。 CREB 的辅激活物雷帕霉素靶蛋白复合物2(Target of Rapamycin Complex 2, TORC2)也是控制糖异生的关键分子开关。 禁食过程中,胰高血糖素刺激TORC2 去磷酸化,进入核内与CREB 结合启动糖异生相关基因的转录[13]。 此外,禁食过程中胰高血糖素通过刺激肌醇三磷酸受体(Inositol (1,4,5)-trisphosphate Receptors 1,INSP3R1)和钙/钙调蛋白激酶II(Ca2+/Calmodulin-dependent Protein Kinase II, CAMK II)的磷酸化,提升了细胞质基质的钙浓度,增强了糖异生基因的表达[14]。 最近一项研究表明,禁食后血液中胰高血糖素含量增加,通过增强cAMP 和PKA 活性, 使叉头转录因子 1 (Forkhead Box O1,FOXO1)在Ser276 位点磷酸化,促进FOXO1 核转位和稳定性,导致下游磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate Carboxykinase, PEPCK)和葡 萄 糖-6-磷 酸 酶 ( Glucose-6-phosphatase,G6pase)的表达[15]。 这些研究表明磷酸化修饰通过激活转录因子进而促进糖异生途径相关基因的表达,以维持禁食期间体内血糖含量。

磷酸化修饰也参与禁食过程脂代谢调控[16]。AMP 依赖的蛋白激酶(Adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated Protein Kinase, AMPK)可感受细胞内AMP/ATP,当AMP/ATP 比值偏高时,AMPK 通过α 亚基Thr172 磷酸化而激活,进而通过磷酸化失活乙酰辅酶A 羧化酶1(Acetyl Coenzyme A Carboxylase 1, ACC1) (Ser79) 和ACC2(Ser212),发挥抑制脂肪酸合成、促进脂肪酸氧化的作用[17]。 肝脏AMPK 通过直接磷酸化脂肪代谢的主要转录调控因子固醇调节元件结合蛋白1c(Sterol Regulatory Element Binding Protein-1c, SREBP-1c)的Ser372 位点,抑制SREBP-1c 基因的表达,进而抑制脂肪酸和胆固醇合成酶的表达,减少脂质合成[18]。 在营养缺乏条件下,活化的AMPK 通过磷酸化PKA Ser568 位点激活PKA,后者磷酸化增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding Proteins α, C/EBPα) Ser196、Ser626 和Thr66 使其失活,从而抑制脂肪合成相关基因的表达[19]。 可见,磷酸化修饰通过活化或激活肝脏糖、脂代谢相关转录因子,进而增强下游相关基因的表达,维持禁食过程中体内能量的稳定。

2.2 磷酸化修饰调控线粒体功能与能量代谢过程

生物酶是代谢过程的掌控者,而磷酸化修饰是代谢生物酶活性调节的重要开关之一。 大多数胞浆及线粒体内的代谢酶均可被磷酸化修饰。

孕烷X 受体(Pregnane X Receptor, PXR)是核受体超家族的成员,被确立为肝脏能量稳态的新调节剂。 小鼠PXR 在配体结合域内的丝氨酸347 处具有保守的磷酸化基序。 Yokobori 等[20]研究证实磷酸化PXR 可以防止禁食期间肝脏糖脂代谢紊乱,保持肝脏能量代谢稳态。 Sueyoshi等[21]证实视黄酸受体α(Retinoic Acid Receptor α, RXRα)在T167A 位点磷酸化修饰可以调节RXR 核质定位,维持禁食期间能量代谢和葡萄糖稳态。 丙酮酸脱氢酶激酶(Pyruvate Dehydrogenase Kinases, PDK)同工酶的活性能影响丙酮酸脱氢酶复合物(Pyruvate Dehydrogenase Complex,PDC)维持血糖和ATP 水平的能力。 在禁食过程中,肝脏线粒体中PDK2 活性升高,使PDC 磷酸化和失活,从而将可利用的葡萄糖主要分配给只能利用糖类为能源的组织[22]。 长期禁食过程中酮体取代葡萄糖成为主要的能量来源,酮体生成限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A 合酶2(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA Synthase 2, HMGCS2)的活性在一定程度上影响禁食过程中酮体生成的效率。 Grimsrud 等[23]采用磷酸化蛋白质组学对禁食小鼠肝脏组织线粒体进行研究发现,HMGCS2 在S456 位点上的磷酸化修饰可以提高其催化酮体生成的活性,保证禁食过程中血液中足够的酮体含量。

大量研究证实,禁食过程中体内多种转录因子、代谢酶等都存在磷酸化修饰,并能通过调节它们的活性,使机体更快速适应外界环境变化,维持禁食期间肝脏能量代谢稳态。

3 乙酰化修饰与禁食肝脏能量代谢

蛋白质乙酰化(Acetylation)是通过酶学或非酶学的方式将乙酰基团共价结合到赖氨酸残基上的过程[24]。 乙酰基转移酶(Histone/lysine Acetyltransferase, HATs/KATs) 和去乙酰化酶(Histone/lysine Deacetylase, HDACs/KDACs)控制这2种活动的动态平衡,是维持体内代谢平衡的关键[25-26]。

3.1 乙酰化修饰参与转录活性调节

蛋白质乙酰化是基因转录的主要调节因子,这些转录因子多数参与机体禁食过程中能量代谢调节。 Hirschey 等[27]利用高效液相色谱/串联质谱(High Perform Liquid Chromatography-tandem Massspectrometry, HPLC-MS/MS)分析确定了133个线粒体蛋白中的277 个赖氨酸乙酰化位点,其中24%的乙酰化位点与禁食相关。 Choudhary等[28]利用高分辨率质谱法鉴定出1750 个蛋白质上的3600 个赖氨酸乙酰化位点,根据细胞功能和蛋白质类别分类发现,29 个发生乙酰化修饰的转录因子上存在40 个乙酰化位点,这些赖氨酸乙酰化修饰的转录因子参与调控多种不同的细胞生物学过程。

在禁食或热量限制期间,胰高血糖素通过多种方式刺激糖异生基因的表达[29]。 禁食状态下,胰高血糖素含量增加使IIa 类组蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylase, HDAC)去磷酸,并将其从细胞质转移到细胞核,从而募集HDAC3 形成复合物并促进FOXO1 的去乙酰作用,增强其转录活性[30]。 此外,胰高血糖素诱导HDAC5 去磷酸化,使其与过氧化物酶增殖激活受体α(Peroxisome Proliferator-activated Receptor α, PPARα)结合作用增强,进而促进脂肪酸氧化相关基因的表达[31]。 禁食状态下,沉默调节因子1(Sirtuin 1,SIRT1)能迅速感受到体内葡萄糖含量的变化,引发过氧化物酶体增殖物激活受体-γ 共激活因子-1α(PPARγCoactivator-1α, PGC-1α)去乙酰化,促进PEPCK 基因的表达,从而加强糖异生作用[32]。SIRT1 对FOXO1 也具有特异性去乙酰化作用,且可同时增强Akt 对FOXO1 磷酸化的敏感性,进而促进糖异生相关基因的表达[33]。 研究表明SIRT1 能使CREB 调节的转录共激活因子2( CREB Regulated Transcription Coactivator 2,CRTC2)去乙酰化,导致CRTC2 降解,从而降低肝脏葡萄糖的产生[34]。 SIRT1 也可以抑制脂质合成并促进脂肪分解,以响应禁食条件下的能量底物需求[35]。 Li 等[36]证实SIRT1 通过去乙酰化作用诱导肝脏成纤维细胞生长因子21(Fibroblast Growth Factor 21, FGF21)的表达,加速脂肪分解过程。 总之,去乙酰化酶通过直接或间接作用参与转录因子或转录辅因子的乙酰化修饰,调控细胞的转录过程,进而调控禁食过程中肝脏能量代谢。

3.2 乙酰化修饰对中间代谢的调控

代谢酶的活性直接影响机体代谢的状态,几乎所有的代谢反应的中间代谢酶都存在乙酰化修饰。 这些代谢酶的乙酰化修饰使得它们能更好地适应不同的营养环境。

PEPCK 是糖异生途径的限速调节酶,Zhao等[37]证实在人PEPCK 含有4 个乙酰化位点,且PEPCK 的稳定性与葡萄糖水平有关。 在禁食条件下体内葡萄糖水平下降,PEPCK 酶的乙酰化水平降低,使其稳定性增加,保证代谢流转向糖异生途径。 糖原磷酸化酶(Glycogen Phosphorylase,GP)是糖原分解的催化限速酶,在维持葡萄糖稳态方面发挥重要作用[38]。 Zhang 等[39]研究揭示胰高血糖素诱导GP 乙酰化降低并导致GP 活性增强,从而使糖原分解产生的葡萄糖增加。 乙酰化修饰不仅可以通过影响代谢酶的活性调控体内血糖水平,也可以影响脂肪酸代谢相关酶的活性。长链酰基辅酶A 脱氢酶(Long-chain Acyl-CoA Dehydrogenase, LCAD) 是脂肪酸氧化的关键酶,Bharathi 等[40]研究证实LCAD 酶在K318 和K322位点的乙酰化水平决定LCAD 的活性,该位点被SIRT3 去乙酰化后可以增强LCAD 的活性。HMGCS2 是酮体生成的限速酶。 Shimazu 等[41]研究表明SIRT3 通过去乙酰化作用调控HMGCS2的活性,进而影响禁食过程中血液中酮体含量。

氨基酸代谢相关酶也受乙酰化修饰调控。 尿素循环是生物体排放含氮代谢废物的主要方式[42-43]。 氨基甲酰磷酸合成酶1(Carbamoylphosphate Synthase 1, CPS1)是催化尿素循环中解氨毒的关键酶。 Nakagawa 等[43]研究表明禁食状态下肝脏线粒体中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide, NAD+) 增加,引发SIRT5 催化CPS1 去乙酰化,并上调其活性,从而使氨基酸分解代谢增加,保证体内氮循环的正常进行。

与磷酸化修饰相似,禁食低代谢状态下肝脏组织乙酰化修饰既可以直接调控转录相关基因活性,也可以直接修饰代谢酶,这种“粗调”与“细调”相结合的方式使乙酰化修饰在禁食低代谢过程中能感知营养状况而改变代谢方向和代谢通路,实现对整个代谢网络的精细调节。

4 O-GlcNAc 糖基化修饰与禁食肝脏能量代谢

糖基化修饰(Glycosylation)是指在糖基转移酶的作用下,将糖类转移至蛋白质或蛋白质上特殊的氨基酸残基共价结合形成糖苷键的过程[44]。氧连β-N-乙酰葡糖胺修饰(O-linked β-N-acetlgluosamine, O-GlcNAc)修饰是一种广泛存在于细胞质/核蛋白的糖基化修饰方式,其最早由Torres 等在鼠类淋巴细胞中发现[45]。 O-GlcNAc 糖基化修饰由O-GlcNAc 糖基转移酶(O-linked N-acetylglucosamine Transferase, OGT)和O-GlcNAc 糖苷酶(O-GlcNAcase, OGA)动态调控。 到目前为止,已发现超过1000 种蛋白质被O-GlcNAc 糖基化修饰。 细胞内O-GlcNAc 糖基化修饰水平受到葡萄糖、游离脂肪酸、氨基酸和核苷酸代谢等多种营养物质含量变化的影响,因此,O-GlcNAc 糖基化也被认为是机体的压力和营养感应器,并能动态调节细胞转录翻译、信号转导和代谢等多种生命活动[46]。

禁食过程中多种糖异生转录因子和辅因子的O-GlcNAc 糖基化修饰参与肝脏葡萄糖的产生。在短期禁食过程中,响应cAMP 和钙信号的变化,CRTC2 在Ser70 和Ser171 位点被去磷酸化和OGlcNAc 糖基化,这促进CRTC2 易位到核中并与CREB 结合,从而加强糖异生作用[47]。 在长期禁食期间,OGT 主要影响PGC-1α 介导的糖异生基因的表达。 宿主细胞因子(Host Cell Factor 1,HCF-1)通过募集OGT 促进其与PGC-1α 的结合,O-GlcNAc 糖基化作用加强PGC-1α 的稳定性,促进了糖异生作用[48]。 葡萄糖激酶(Glucokinase,GCK)是调节肝脏中葡萄糖的流量和使用的主要酶。 Baldini 等[49]研究证实GCK 的表达由葡萄糖通过O-GlcNAc 糖基化修饰调节。 雌激素相关受体γ(Estrogen Receptor-related Receptorsγ,ERRγ)在调节小鼠肝脏中的葡萄糖、脂质代谢中起重要作用[50]。 禁食条件下ERRγ 的S317 和S319 位点发生糖基化修饰,使得ERRγ 蛋白质稳定性增加,从而促进下游糖异生相关基因的表达[51]。

上述研究表明,O-GlcNAc 糖基化修饰参与禁食低代谢过程中多种蛋白质的修饰,对细胞外营养环境变化做出快速应答反应。 O-GlcNAc 糖基化修饰既可以通过调节转录活性、蛋白质在细胞内定位等方式参与禁食过程中机体能量代谢调节。

5 琥珀酰化修饰与禁食肝脏能量代谢

琥珀酰化修饰(Succinylation)是将琥珀酰基加到蛋白质分子的赖氨酸残基上的过程[52]。 发生琥珀酰化的赖氨酸基团被赋予2 个负电荷,价态从+1 变成-1,能够引发更多蛋白质特性的改变,且琥珀酰基团空间结构较大,对于蛋白质结构和功能的影响更为显著[53]。 琥珀酰化修饰参与糖酵解、氨基酸代谢、脂肪酸代谢等多种途径的调节[54-55]。

5.1 琥珀酰转移酶对酶活性的调节

细胞内琥珀酰辅酶A 和赖氨酸琥珀酰转移酶对琥珀酰化修饰发挥正向调控作用[56]。 α-酮戊二酸脱氢酶复合物(α-Ketoglutarate Dehydrogenase, α-KGDH)与赖氨酸酰基转移酶2A(Lysine Acetyltransferase 2A, KAT2A) 中的酪氨酸645(Y645)结合并将琥珀酰基转移酶至组蛋白H3,催化H3K79 发生琥珀酰化修饰;而阻止α-KGDH 进入细胞核或突变Y645 为丙氨酸会导致H3K79 琥珀酰化降低[57]。 脂肪酸氧化途径的关键酶肉碱棕榈酰转移酶(Carnitine Palmitoyltransferase 1a, CPT-1a)也可以作为琥珀酰基转移酶,参与调控多种底物蛋白及相关代谢过程[58]。

5.2 去琥珀酰化修饰在肝脏糖脂代谢中的调节

体内琥珀酰化水平处于一个动态平衡的状态。 SIRT5 是体内重要的去琥珀酰化修饰酶[59]。SIRT5 敲除小鼠中,涉及主要代谢途径的140 种蛋白质上共有386 个位点被鉴定为高度琥珀酰化(与野生小鼠相比,琥珀酰化至少增加2 倍)。 Ye等[60]研究表明SIRT5 通过下调M2 型丙酮酸激酶(Pyruvate Kinase M2, PKM2)K498 位点的琥珀酰化水平抑制PKM2 的活性,从而抑制丙酮酸的生成;SIRT5 去琥珀酰化并激活异柠檬酸脱氢酶2(Isocitrate Dehydrogenase-2, IDH2),催化NADP+依赖的异柠檬酸氧化脱羧为α-KG,产生NADPH和CO2[61];相反,SIRT5 催化的去琥珀酰化抑制SDH 的活性影响三羧酸循环[62]。 在脂肪酸代谢过程中,SIRT5 去琥珀酰化并增加超长链酰基辅酶A 脱氢酶(Very Long-chain acyl-CoA Dehydrogenase, VLCAD)的活性以促进脂肪酸氧化的通量[63]。 SIRT5 还可以通过作用于烯酰辅酶A 水合 酶(Enoyl-CoA Hydratase, ECHA) α 亚 基 的K351 位点上调ECHA 的活性,促进脂肪酸氧化[64]。 此外,SIRT5 通过去琥珀酰化作用调节HMGCS2 以及其他参与生酮作用的酶的活性,SIRT5 缺失导致HMGCS2 的过度琥珀酰化和活性降低[65]。

综上所述,琥珀酰化是一种丰富的翻译后修饰,其对机体整个代谢过程的影响更加广泛,且作用更加显著、反应更加迅速。 SIRT5 是琥珀酰化修饰对许多代谢酶的关键调节剂。 虽然在机体中已经鉴定出多个SIRT5 直接作用的底物,且已证实其在能量代谢中的调控作用,但是,禁食过程中SIRT5 调控的去琥珀酰化修饰对机体带来的影响尚不清楚。 因此,仍需要更多的工作来更好地了解禁食过程中可逆琥珀酰化修饰对这些酶和随后的细胞生理学过程的影响。

6 展望

禁食低代谢作为目前最具应用潜能和可实现性的空间低代谢调节技术被广泛研究[1]。 禁食可以显著降低机体静息能量代谢率,使其具备用于解决载人星际航行载荷问题的潜力,但仍需提高禁食低代谢技术的低代谢诱导效率。 蛋白翻译后修饰能够感知机体不同生理、营养状态,影响蛋白的活性、稳定性、细胞内定位以及信号转导等,实现对功能蛋白的活化、转位、组装等过程的调节。 蛋白质翻译后修饰比转录水平调控更加精细,对环境中微小变化也能产生精确的微调,而不会给机体带来更多的能量消耗。 这种低耗能模式对于机体维持禁食低代谢状态至关重要。 研究蛋白质翻译后修饰,不仅能在分子水平上揭示禁食低代谢过程中复杂的蛋白质功能变化,更好地了解机体面对营养缺乏时的自身调节机制,也有利于了解关键调节酶的修饰类型,从而为寻找高效的禁食低代谢诱导靶点提供参考。 然而,蛋白质翻译后修饰的普遍性、多样性、动态性和复杂性,导致在整体水平上认识禁食过程中体内发生的翻译后修饰仍有困难。 但是从不同翻译后修饰在禁食低代谢过程中参与机体能量代谢的方式可以看出,这些翻译后修饰对机体代谢的调控作用大致分为2 个层次:第一,转录因子的翻译后修饰直接调控代谢酶的表达量,属于“粗调”。 这种修饰层面的调节可以在更长远的方面影响机体代谢的水平。 第二,代谢酶的翻译后修饰直接影响酶活性,属于“细调”。 这种修饰层面的调节能根据体内营养水平做出快速的反应。 此外,大量研究也表明,多种不同的翻译后修饰之间存在相互交叉或共同调节某一代谢酶的现象,这也进一步证实了体内能量代谢调节的复杂性。

面对复杂的蛋白质修饰,在未来探索通过改变蛋白质修饰水平提高空间低代谢诱导效率的技术研究中,可以从蛋白质组学的角度详细、系统地研究蛋白质翻译后修饰与能量代谢的内在联系。以糖、脂代谢相关的蛋白质修饰研究为基础,探索蛋白修饰酶类和底物通过何种网络以及分子机制进行调控,挖掘不同调控层次的协作调控方式。此外,针对糖、脂代谢关键调控因子的修饰类型,寻找一种有效的修饰调节靶点,针对性的诱导修饰后变化的发生,提高低代谢的诱导效率。 这些工作将为深入研究禁食过程中机体能量代谢转换机制奠定基础,也将为寻找更好的空间低代谢调节手段提供依据。