镰刀菌对太子参品质影响及DON毒素在其煎煮过程中迁移规律研究△

陈叶飞，袁青松，*，汪露，邓桃，郭兰萍，周世华，杨昌贵，康传志，高彦平，周涛*

1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025；

2.中国中医科学院 中药资源中心 道地药材品质保障与资源持续利用全国重点实验室，北京 100700

太子参为石竹科植物孩儿参Pseudostellaria heterophylla（Miq.）Pax ex Pax et Hoffm.的干燥块根，具有益气健脾、生津润肺功效[1]，能够降血糖、抗应激、抗氧化、保护心肌及改善记忆力等[2]，广泛应用于制药、食品等行业。目前，有26 个成方制剂中含有太子参，2020 年太子参药材的需求量高达152 700 t[3]。贵州、福建等太子参主产区以山地、丘陵为主，耕地资源有限，为满足市场供给，普遍采用重茬种植，这导致太子参根腐病等真菌病害频发。研究表明，太子参根腐病常年发病率在20%以上，可导致产量损失20%～80%，严重的甚至导致绝收。已有研究表明，镰刀菌属真菌尖孢镰刀菌是太子参根腐病的主要病原菌，能够产生单端孢霉烯类真菌毒素。本课题组前期从发病严重田块采集太子参病害样本，分离得到产脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）毒素的镰刀菌占比近1/2，且在发病严重的太子参块根中DON 毒素质量分数高达100 mg·kg-1[4]。DON毒素污染导致的食品安全问题在小麦、玉米等农作物中也广受关注[5-8]。显然，镰刀菌等真菌引发的毒素污染问题已严重威胁到食药安全。

国家对中药材外源真菌毒素污染监测越来越关注，但中药材炮制、煎煮等过程中的DON 毒素迁移转化规律迄今未见报道。本研究参考太子参常规煎煮流程，在人工控制对比试验条件下，采用反式培养法探究镰刀菌侵染太子参药材后DON 毒素积累变化及镰刀菌侵染对太子参质量的影响，探讨太子参煎煮前后DON 毒素的迁移规律，为中药材外源污染限量标准研究和临床安全用药提供参考。

1 材料

1.1 样品

太子参药材采购于安徽亳州中药材交易市场，由贵州中医药大学江维克教授鉴定为石竹科植物孩儿参Pseudostellaria heterophylla（Miq.）Pax ex Pax et Hoffm.的干燥块根。实验菌株为尖孢镰刀菌Fusarium oxysporumHP-2c菌株，保存于贵州中医药大学中药民族药资源研究院。

1.2 仪器

e2695 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；BX41型摄像生物显微镜（日本奥林巴斯有限公司）；UV-2700 型紫外分光光度计（苏州岛津仪器有限公司）；CFx96 Touch 型梯度荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪（美国Bio-Rad公司）。

1.3 试药

对照品太子参环肽B（HB，批号：111887-201001，纯度：99%）、D-无水葡萄糖对照品（批号：110833-201707，纯度：99%）购于中国食品药品检定研究院；人参皂苷Rb1对照品（批号：AZ21090302，纯度：99%，成都埃法生物科技有限公司）；SYBR Green Mix（批号：H183，北京百奥菜博科技有限公司）；其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 DON 毒素迁移转化规律分析

2.1.1 镰刀菌孢子液的制备 将产DON 毒素病原菌镰刀菌接种到马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基活化，25 ℃培养2 d后，挑取菌丝块置于马铃薯葡萄糖（PDB）液体培养基中，于25 ℃振摇培养5 d。将培养好的菌液用无菌纱布滤过，12 000 r·min-1离心10 min（离心半径为10 cm，下同）收集孢子液，无菌水重悬孢子，调节孢子浓度为1×107CFU·mL-1备用。

2.1.2 毒素污染样品制备 称取太子参药材50 g于无菌组培瓶，取浓度为1×107CFU·mL-1镰刀菌孢子液1 mL 均匀喷洒到太子参药材上，以相同体积的无菌水处理为对照，于28 ℃下分别培养10、20 d。取10、20 d 培养的太子参块根用于外观和显微观察，另取一部分太子参块根烘干用于DON 毒素和太子参主要成分检测。

2.1.3 药材、煎煮液和残渣样品的制备 将2.1.2项下干燥的太子参药材粉碎，过筛，精密称取1 g，按文献[9]方法提取毒素。称取毒素污染太子参药材12 g，加水120 mL，煎煮2 h，滤过，水浴蒸干，用70%甲醇25 mL 溶解，超声20 min，10 000 r·min-1离心5 min，取上清液，即得煎煮液和残渣样品。

2.1.4 DON 毒素含量测定 取太子参药材、煎煮液和残渣样品，采用高效液相色谱法（HPLC）进行检测[5]。按公式（1）计算转移率。

2.2 太子参外观显微观察

分别取未染菌，镰刀菌侵染10、20 d 的太子参药材，在体视显微镜下观察其表面色泽变化、是否含有霉层等。

2.3 镰刀菌侵染太子参情况观察

分别取未染菌和镰刀菌侵染10、20 d 的太子参药材，切片，以水合氯醛透化，乳酸-棉兰染色剂染色，装片，在荧光显微镜下观察镰刀菌菌丝侵染太子参的程度。

2.4 镰刀菌丰度的测定

按文献[10]中十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取DNA，采用PCR 仪定量目的基因，SYBR Green Mix 标记目的基因内转录间隔区2（ITS2），引 物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。定 量PCR 程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40 个循环；在72 ℃下读板5 s。熔解程序：95 ℃变性20 s，降温至58 ℃退火20 s，按0.05 ℃·s-1升温至95 ℃，变性DNA 产物。反应体系：正、反向引物各1 μL，DNA 模板5 μL，SYBR Green Mix 10 μL，RNasefree ddH2O 3 μL，总反应体系为20 μL。

2.5 太子参品质分析

按文献[11-13]，分别测定太子参粗总皂苷、多糖、HB 等主要成分含量；按《中华人民共和国药典》2020 年版太子参项下方法测定水分、灰分及浸出物含量[1]。

3 结果

3.1 镰刀菌侵染对太子参干药材外观的影响

分别取未染菌、镰刀菌侵染10、20 d 的太子参药材于体视显微镜下观察，发现镰刀菌侵染10、20 d 后药材外表变黑失去光泽，表面有1 层白色菌丝和黑色沉积物形成（图1），表明产DON毒素镰刀菌侵染严重影响太子参药材品相。

3.2 镰刀菌侵染太子参情况观察

如图2 所示，对照组太子参未受镰刀菌侵染，在镰刀菌侵染10 d 后，太子参皮层以外位置发现被染为蓝色的菌丝，皮层以内未观察到镰刀菌菌丝，镰刀菌侵染太子参20 d 后，镰刀菌菌丝已通过皮部进入太子参薄壁组织。

图2 镰刀菌侵染太子参显微图

3.3 不同侵染时间镰刀菌丰度变化

不同侵染时间镰刀菌丰度变化检测结果表明，随侵染时间增长，镰刀菌丰度呈显著上升趋势。侵染10、20 d，镰刀菌丰度分别为1.085×1014、2.763×1014copies·g-1。

3.4 镰刀菌侵染太子参后的DON毒素含量分析

分别对未染菌和镰刀菌侵染10、20 d 药材原液中的DON 毒素含量进行检测，其毒素质量分数分别为37.90、45.40 μg·kg-1，对照组未检测到DON毒素。

3.5 镰刀菌侵染对太子参主要成分的影响

太子参主要药效成分有多糖、皂苷和环肽类。受镰刀菌侵染10、20 d 后，其多糖质量分数分别增至15.41%、14.17%，对照组为9.44%；总皂苷质量分数分别为1.093%、1.403%，对照组为0.728%。与对照组相比，镰刀菌侵染太子参后多糖、皂苷的含量均增加了1.5 倍以上。而药材中的HB 含量则随共培养时间增长逐渐下降，分别为0.005 7%、0.005 4%，与对照组差异有统计学意义（P<0.05），药材受侵染后HB 含量下降约1/2。

3.6 镰刀菌侵染对太子参药材水分、总灰分及浸出物的影响

与对照组相比，镰刀菌侵染能显著降低太子参的水分含量，侵染10、20 d 后水分分别下降至7.54%、7.74%；浸出物含量呈下降趋势，在镰刀菌侵染20 d 时与0 d 差异有统计学意义；而总灰分质量分数在受侵染10、20 d 后分别为2.294%、2.528%，对照组为2.007%，表现为上升趋势。

3.7 太子参主要成分与DON毒素的相关性分析

相关性分析结果显示，太子参3 种活性成分与DON 毒素含量均存在显著相关性，其中太子参皂苷、多糖与DON毒素含量呈显著正相关（P<0.01），随着多糖皂苷含量升高，DON 毒素含量显著升高；HB与DON毒素含量呈显著负相关（P<0.01），DON毒素含量升高，HB含量显著降低。

3.8 DON毒素迁移规律

在镰刀菌侵染10 d 样本中，DON 毒素转移到煎煮液中的转移率为12.50%，残留在太子参中的比率为57.60%；在镰刀菌侵染20 d 样本中，DON毒素转移至煎煮液中的转移率为27.90%，DON 毒素残留在太子参中的比率为61.30%，说明随着镰刀菌侵染的时间延长，DON 毒素的转移率也随之升高。

4 讨论

中药材历来就有“辨状论质”的传统，好的质量往往表现为好的外观。本研究在可控条件下研究镰刀菌对太子参药材品质的影响及太子参药材在煎煮过程中DON 毒素的迁移规律。镰刀菌侵染会使药材表面发黑、失去光泽，且会在药材表面生成白色菌丝及黑色沉积物，严重影响药材品相，使其丧失药用价值。镰刀菌通过侵染植物可产生DON 毒素，随着侵染时间增加，太子参中镰刀菌丰度与DON 毒素含量均达到峰值，太子参中总皂苷和多糖含量分别增加1.5、2.0 倍，HB 含量显著降低。侵染20 d后积累的DON 毒素质量分数达到45.40 μg·kg-1，这提示镰刀菌侵染不仅可能降低太子参药效，真菌产生的DON 等毒素还严重影响人体健康。

内生真菌可以从宿主植物中吸收营养物质供给自身生长发育的需要，并产生与宿主相同或相似的次生代谢产物[14-15]。本研究中太子参多糖、皂苷含量随镰刀菌侵染时间的延长而上升，这可能与镰刀菌能产生多糖和皂苷有关。但镰刀菌侵染太子参后显著降低了HB 含量，这可能是因为太子参环肽类物质主要位于皮部及须根中[16]，该部位作为镰刀菌最先侵入的位置受到破坏，导致HB含量降低。

有文献报道，在中药材僵蚕、莲子、远志用药过程中，分别只有4.37%、14.19%、13.79%的黄曲霉毒素B1转移至汤剂中[9]，而本研究表明，镰刀菌侵染10、20 d 后的太子参药材煎煮后，仍有12.50%、27.90%的DON 毒素转移至汤剂中。这提示在中药饮片的毒素限量标准制定研究中，应综合考虑毒素在不同溶剂中的溶解度、中药材炮制后的转移率及对人体健康不造成威胁的最低毒素含量，经过综合评定才能制定科学合理的毒素限量标准。本研究主要分析了水煎过程中DON 毒素转移规律，在后续研究中还要充分考虑汤剂制备工艺对DON 毒素转移的影响，如中药汤剂煎煮器具、煎煮用水量、煎煮火候、煎煮时间及煎煮次数等对DON 毒素转移的影响。