鹿角与鹿角脱盘显微鉴定研究△

邸学，王斐娴，任聪，李峰*

1.辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600；

2.烟台毓璜顶医院，山东 烟台 264099

鹿角始载于《神农本草经》，附于鹿茸项下，列为上品[1]。《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版收载为鹿科动物马鹿Cervus elaphusLinnaeus 或 梅花鹿C.nipponTemminck 已骨化的角或锯茸后翌年春季脱落的角基，分别习称马鹿角、梅花鹿角、鹿角脱盘[2]。鹿角作为传统中药，其性温，味咸，归肾、肝经；具有温肾阳、强筋骨、行血消肿的功效，用于肾阳不足、阳痿遗精、腰脊冷痛、阴疽疮疡、乳痈初起、瘀血肿痛[2-3]。

鹿角与鹿角脱盘为中药鹿角药材的不同药用部位，文献记载两者的功效基本相同[2]，但是由于鹿角脱盘质地更加坚硬，市场上多以鹿角脱盘粉销售，且价格远高于鹿角粉；现代研究表明鹿角脱盘与鹿角无论是化学成分还是药效作用上尚有一定的差异[4-11]。为有效鉴别鹿角脱盘粉与鹿角粉，以及在两者中混入鹿骨粉等现象，本研究从显微结构的角度，分别以表征其骨化程度的显微特征骨陷窝长/短径比和骨陷窝面积比为鉴定参数[12-13]，通过对比鹿角脱盘、鹿角及鹿骨的不同骨化程度部位中的显微特征参数值，揭示三者显微结构上的差异，以期为鹿角脱盘粉与鹿角粉鉴定、阐释鹿角脱盘与鹿角质地差异的本质奠定基础。

1 材料

1.1 样品

鹿角、鹿角脱盘、鹿骨药材的来源、规格见表1，经辽宁中医药大学李峰教授鉴定为鹿角（Cervus elaphusLinnaeus orC.nipportTemminc）、鹿角脱盘（C.elaphusLinnaeus orCervus nipportTemminc）、鹿骨（C.nipportTemminc）正品药材。

表1 鹿角与鹿角脱盘样品来源

1.2 仪器

SL-BI-S-2 型普通光学显微镜、System Biologic Microscope BX-51、DP10 型显微镜数码相机均购于奥林巴斯有限公司。

1.3 试药

水合氯醛、稀甘油均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；纯净水（娃哈哈股份有限公司）。

2 方法

2.1 显微粉末制片

分别取干燥至恒重的10 批样品粉末，过80 目筛。再取过筛后的粉末，按《中国药典》2020 年版（四部）显微鉴别法中药材粉末的制片方法[14]，制成水合氯醛透化片15张。

2.2 显微特征观察

分别取各样品透化片10 张，并置于光学显微镜下，对显微结构中的骨碎片及其骨陷窝形态、棕色块及未骨化组织特征进行观察，拍照，记录。

2.3 显微特征参数测量[15]

于40 倍物镜下，应用软件Digital Camera Software[C-3.0W95E]分别测量其骨陷窝的长径、短径及其面积。并按公式（1）分别计算样品中骨陷窝面积占骨碎片面积比，式中S1、S2......Sn为同一骨碎片上个骨陷窝面积，S片为骨碎片面积。

骨陷窝面积比＝（S1+S2+S3+...+Sn）/S片×100% （1）

3 结果

鹿角、鹿角脱盘及鹿骨中均可见骨组织中的骨疏质碎片、骨密质碎片及棕色块等显微结构。在2种骨组织碎片中，以骨疏质碎片上的骨陷窝特征最为突出，也是脊椎动物药材显微鉴定的主要特征，通常简称为骨碎片[16]；而骨密质碎片则表面特征不明显。

3.1 骨碎片

鹿角中骨碎片较多，淡棕色或黄色，呈不规则形。骨碎片上有较多的骨陷窝，排列较密集，呈黑色，少见无色，大多为类圆形或类梭形；鹿角脱盘的骨碎片也为不规则形状，呈淡黄色，其上骨陷窝排列较稀疏，呈无色或黑色，大多为长椭圆形或类梭形；鹿骨中主要为骨碎片结构，其颜色为黄色，形状不规则，骨碎片上有密集的骨陷窝，呈黑色，多为类圆形，有的边缘骨小管较清晰，呈放射状沟纹（图1、图2）。

图1 鹿角、鹿角脱盘及鹿骨的骨碎片显微特征

图2 鹿角、鹿角脱盘及鹿骨的骨陷窝显微特征

3.2 棕色块

鹿角及鹿角脱盘样品镜下均可观察有棕色块，形状不规则，大小不一。其中鹿角中棕色块呈淡黄色，鹿角脱盘的则呈红棕色（图3），鹿骨中无棕色块。

图3 鹿角与鹿角脱盘中棕色块显微特征

3.3 骨密质碎片

鹿角和鹿角脱盘样品中尚可观察到骨密质碎片。其形态为不规则块状，呈淡黄色，表面具不规则的突起（图4）。总体上比较，鹿角中骨密质碎片较少，而鹿角脱盘中骨密质碎片较多。

图4 鹿角和鹿角脱盘中骨密质碎片显微特征

3.4 显微特征参数

实验结果显示（表2），鹿角骨碎片镜下观察，其骨陷窝多为长条形，长/短径比值为1.69～2，骨陷窝面积占骨碎片面积比为40.60%～61.77%；鹿角脱盘上的骨陷窝长/短径比值为分别为2.04～2.38，面积比为35.04%～45.82%。因此，从骨陷窝的形态上，发现鹿角脱盘的骨陷窝形态比鹿角的骨陷窝形态偏长，且其骨陷窝面积比较鹿角的骨陷窝面积比偏小；鹿骨的骨陷窝长/短径比值则为1.54，面积比为71.8%，即鹿骨的骨陷窝形态接近圆形，其面积比最大。

表2 鹿角、鹿角脱盘及鹿骨显微特征参数测定结果（,n=30）

表2 鹿角、鹿角脱盘及鹿骨显微特征参数测定结果（,n=30）

4 总结与讨论

传统中医理论认为中药鹿角均具有温肾阳，强筋骨，行血消肿的功效，临床用于肾阳不足、阳痿遗精、腰脊冷痛、阴疽疮疡、乳痈初起、瘀血肿痛等证[1]。从其功效与临床应用可以看出，其主要是“补肾健骨”和“行血消痈”2 个方面，这两方面的作用本质是其不同药效物质决定的，而不同药效物质又决定于其生物学结构的差异。本研究通过比较鹿角脱盘、鹿角及鹿骨粉末显微结构发现，三者骨碎片中的骨陷窝形态（长/短径比值）和骨陷窝面积比均具有明显的差异性。同时由表2 可见，无论是梅花鹿还是马鹿，其脱盘的骨陷窝形态（长/短径比值）与骨陷窝面积比均相似，即表明其骨化程度接近，这与它们同为长新角前脱落相吻合；至于马鹿角与梅花鹿角的差异，由于梅花鹿角样品较少，且粉末药材无法判定其生长年限，因此是否存在种间差异有待进一步研究。研究结果表明，表征其骨陷窝形态的骨陷窝长/短径比值和骨化程度的骨陷窝面积比，可作为三者鉴定的重要显微特征参数，并用于鉴别鹿角脱盘粉与鹿角粉及以鹿骨充伪等情况。

由哺乳动物角的形成可知[17]，鹿角为其皮肤的衍生物，系皮肤的真皮部分骨化而成（故鹿角属骨质角，即实角），而鹿角脱盘与鹿角兼具皮肤和骨的双重特性，并随其生长时期的不同此消彼长。从动物皮肤的角度分析，由于鹿角为其真皮发育形成，而真皮层的主要结构是致密的结缔组织，使动物的皮肤或是其衍生物（角）具有坚韧和弹性[17]，导致皮肤衍生初期的鹿角脱盘，较皮肤衍生发育期的鹿角具有更大的硬度和韧性，这与本研究中的鹿角脱盘的骨陷窝面积比较小，骨化程度较低，而鹿角的骨陷窝面积比较大，骨化程度较高的结果相吻合。此外，动物真皮结构中还含有血管、神经及色素细胞等，可维持其脱盘脱落后角的再生与生长（骨化）。对比鹿角与鹿角脱盘的显微结构，整体上鹿角脱盘样品的棕色碎块颜色偏红，多呈红棕色；而鹿角中的偏黄，多呈浅黄棕色，应与鹿角脱盘更接近于皮肤，受血液供养较充足有关。同时依据脊椎动物骨骼结构，骨质角属于皮性硬骨（或称膜性硬骨），即在结缔组织的基础上直接由造骨细胞形成。其结构中包含外层由骨板构成的骨密质和内部由骨小梁（其上有骨陷窝和骨小管[16]）、骨髓质部分组成的骨疏质[17]；在骨形态学中，骨小梁面积是骨向分化的标志性指标[18]，即骨小梁面积增加，表明骨化程度增加。因此，表征骨疏质的骨陷窝形态（长/短径比值）和骨陷窝面积比，能够表征鹿角脱盘到鹿角的不同骨化程度。也就是说，鹿角脱盘与鹿角不仅属于不同的药用部位，而且其骨化程度存在明显差异性。从两者生成机制与其显微结构上看，其坚硬的质地与其骨化程度有关；随着其骨化程度增加，即骨陷窝形状由近圆形逐渐形成椭圆形或长条形、骨陷窝面积比增加，其硬度势向降低。

本项目组前期研究表明，鹿角与鹿角脱盘不仅在显微结构上具有明显的区别，两者在化学成分上也存在一定的差异[11]。通过对其主要化学成分多糖、磷脂、蛋白质与氨基酸、核苷、多胺等分析结果显示，鹿角脱盘与鹿角在多糖、磷脂类成分上存在显著性差异；而其他类成分的差异性较小。在差异性成分上，其总多糖含量鹿角脱盘显著高于鹿角，表明随着鹿角的骨化程度增加，其总多糖的含量降低，并且两者在检出的7 种单糖中，其构成比例也明显不同；而磷脂类成分中，其总磷脂及磷脂酰胆碱含量均为鹿角的高于鹿角脱盘，即随骨化程度增加，磷脂类成分含量增加，这与脊椎动物硬骨的化学成分相一致（脊椎动物的硬骨内含65%的无机盐，其中绝大部分是磷酸钙）[17]。在相似性成分上，鹿角与鹿角脱盘中的蛋白质和水解氨基酸含量属于动物药材中含量较低的，应与其为皮肤衍生物及骨化有关；小分子核苷类成分中，因其含量较低，两者差异性较小；多胺类成分中的腐胺，两者含量有差异（鹿角脱盘含量略高）但不显著。这几类成分均具有补益的作用，可见两者的补益功效没有显著差异。从中药鹿角临床应用的角度，若以补肾健骨作用为主，从有效物质蛋白质和氨基酸、核苷类成分等含量相似上分析，鹿角与鹿角脱盘两者可同用；但如侧重鹿角的活血消痈功效，则从其有效物质多糖类成分含量差异的角度，鹿角与鹿角脱盘应分开使用，以确保其临床疗效。