数字PCR 芯片的荧光图像处理与分析*

朱飞彪 汪 磊 朱 灵 郑贤锋

（1.安徽师范大学物理与电子信息学院 芜湖 241000）

（2.中国科学院合肥物质科学研究院安徽光学精密机械研究所 合肥 230031）

1 引言

随着微纳米制造技术和微流控技术的不断进步，微腔式数字PCR芯片体积更小、通量更大、成本更低。数字PCR 技术和传统的实时荧光定量PCR技术相比，将检测灵敏度提高至单个核酸分子，直接通过分析终点荧光图像的荧光信号值实现核酸分子的绝对定量［2］。

通常，利用网格对微反应腔室进行划分和定位，然后对每个腔室的荧光信号进行判断，统计阳性荧光点。由周淑芳等提出，先人为确定荧光图像中三个顶角微反应腔室的中心位置，利用最大化引力方程进行修正，基于投影法实现图像的网格划分和中心定位，根据定位实现图像拼接和阳性腔室识别［3］，对于信号较弱或者阴性腔室比例大的图像可能造成网格划分不准的情况，而且需要手动辅助操作。许静等提出通过计算提取的轮廓周长，并设置双阈值筛选出阳性腔室［4］，该方法对于腔室之间或者腔室与污点之间存在粘连的情况，易将阳性腔室错误地排除，引起结果的误差。

针对上文提到方法的不足，本文提出通过形态学处理将粘连的阳性腔室分开并去除非目标小颗粒噪声，然后用连通域标记的方法对阳性信号点进行统计，同时为了减小噪声对结果的影响，分别对每一连通域求面积，从所有连通域中剔除面积较小的，剩下的连通域个数作为阳性荧光信号点的最终数量，并且不需要对每个腔室进行精确定位处理，也不需要人工干预。

2 数字PCR芯片荧光图像处理方法

本文数字PCR芯片荧光图像处理过程包括：首先对采集到的荧光图像使用加权平均值法进行灰度处理，基于SURF 算法对荧光图像进行拼接，然后对拼接后的荧光图像灰度化处理，通过中值滤波法对图像进行滤波降噪，之后，基于大津法对图像进行阈值分割获得二值化图像，继而通过形态学处理方法对二值化图像进行处理，消除阳性腔室之间的粘连同时消除非目标小颗粒噪声，最后基于连通域标记法实现对阳性腔室的识别和统计。

2.1 荧光图像拼接

2.1.1 图像预处理

首先把拍摄到的荧光图像依次从文件夹中读取出来。采集到的原始图像通常包含了大量的色彩信息，图像灰度化可以在保证图像整体色彩及亮度等级分布特征与彩色图像描述一致的前提下，有效缩减后期处理的信息量，图像处理和识别的速度能够大大提升。本文采用加权平均值法对原始图像进行灰度化处理，该处理方法原理是将三通道RGB的灰度值按一定比例相乘，然后将其得到的灰度值相加在一起。数学公式如下：

其中，(i,j) 表示图像中像素点的坐标，R(i,j) ，G(i,j) ，B(i,j) 分别表示该像素的红绿蓝分量，Gray(i,j)表示灰度化后像素的灰度值。

2.1.2 图像拼接

在用生物相机拍摄数字PCR 芯片的荧光图像时，由于摄像机的像素是一定的，当拍摄的范围越大时，拍摄得到的荧光图像的分辨率就会越低，另外，摄像机镜头在成像时会存在一定的像差，导致图像在靠近中心的位置比较清晰而在靠近边缘的位置就比较模糊。鉴于所述原因，通过多次拍照然后经过图像拼接技术解决视场和分辨率矛盾的问题以及减小像差对图像质量的影响问题。

基于特征信息的图像配准方法和基于灰度信息的图像配准方法是常用的两种图像配准方法［5］。基于灰度的图像配准方法对图像的每一像素点的依赖性都很强，算法的计算量非常大，因此效率较低，基于特征信息的图像配准方法在很大程度上能够克服这个缺点［6］。本文利用SURF（Speeded up robust features，快速鲁棒特征）算法对待拼接的图像进行特征点的提取和特征点的匹配。具体拼接过程如下。

1）特征点检测

SURF算法的特征点检测是基于尺度空间理论的，通过计算图像所有像素Hessian 矩阵行列式的极值点来定位特征点所在的位置［7］，假设一个图像的函数为f（x，y），图像中的点为（x，y），在σ的尺度下，其Hessian矩阵定义为

其中：LXX(x,σ)，Lxy(x,σ)，Lyy(x,σ)是图像f（x，y）上的点（x，y）与高斯函数二阶微分在点（x，y）处的卷积。

为了降低计算量提高运算速度，在特征点提取过程中使用9*9 的盒状滤波器代替σ＝1.2 的二阶高斯滤波器，方框块波模板同图像卷积后的值分别为Dxx、Dxy、Dyy［8］，那么Hessian矩阵可以简化为

通过使用图像金字塔实现图像的尺度空间的构建，在响应图像上采用非极大值抑制（non-maximum suppression，NMS）的方法在图像中初步定位特征点［9］。由于离散化，前面所检测到的特征点的位置往往并不是精确的位置，因此还要应用泰勒级数展开式来进行插值计算，通过三维线性插值法对候选特征点进行亚像素级定位，同时删除低于阈值的点，得到精确定位的特征点。

2）特征点描述

通过识别特征点的主方向让图像的特征点获得旋转不变性。首先加权计算以特征点为圆心，6σ（σ为特征点所在的尺度值）为半径的圆形邻域内的点在x和y方向的Haar 小波响应，然后统计60°扇形区域内全部点的水平和垂直haar小波响应值总和，遍历整个圆形区域后，将最大值所在扇区域的方向作为该特征点的主方向［10］。

在确定特征点的主方向以后，沿主方向以特征点为中心构建边长为20σ×20σ的正方形区域并划分为4×4 个子区域，计算每个子区域5×5 个采样点相对于主方向的水平和垂直方向的Harr 小波响应值，分别计为dx和dy，并赋予不同的高斯权重系数，然后对响应值进行统计（∑dx，∑dy，∑|dx|，∑|dy|）得到四维的特征向量［11］，那么所有子区域向量就构成了该特征点的4×4×4=64维的SURF特征描述向量。

3）特征点匹配

对特征点的匹配采用特征点特征向量的欧氏距离作为两幅图像中特征点的相似性判定度量，在第二幅图像中找出与第一幅图像中特征点欧式距离最近和次近的两个特征点，如果最近距离与次近距离的比值小于比例阈值，就把距离最近的这一对特征点作为匹配点［12］。然后采取RANSAC（Random Sample Consensus，随机采样一致性）算法剔除误匹配点。

4）图像融合

用匹配点对计算仿射变换模型参数，然后根据仿射变换模型对荧光图像进行拼接融合，最终获得荧光图像全景图像。

图1 是对数字PCR 芯片拍摄的三幅荧光图像，图像之间存在一定的重叠部分，图2 就是拼接之后的芯片荧光全景图像，拼接后的图像没有接缝而且信息完整。

图1 原始荧光图像

图2 拼接后图像

2.2 阳性腔室的识别和统计

2.2.1 阈值分割

通常，在获取图像和传输图像的时候难免会被各种噪声污染，引起图像质量的变差，影响图像进一步的处理和分析，为了降低后期图像处理的难度同时提高数据的精度，要在尽量保持图像中目标不改变的情况下对噪声进行抑制。本文采用中值滤波法对图像进行降噪，中值滤波法是常用的非线性滤波方法，可以有效地消除图像中的椒盐噪声，而且对高斯噪声也有一定的抑制作用，并能够很好地保留图像边缘信息，降噪效果较为理想［13］。

图像的阈值分割是一种在数字图像处理过程中应用较为广泛的的图像分割技术，它利用了图像中要提取的目标物与其背景在灰度特性上的差异，按照一定的规则在数字图像中确定一个最佳的灰度值作为阈值，把每一个像素点的灰度值与所确定的阈值相比较，通过判断将图像分割成目标和背景两部分，从而产生相应的二值图像［14］。假设确定了图像f（x，y）的阈值为T，那么阈值分割后的图像g（x，y）为

图像的阈值分割不仅能够大大减少图像在后续处理和分析过程中的数据量，进一步提高处理的运算速度，而且使得目标区域的特征信息更加显著，降低图像中目标辨识的复杂性，提高结果的准确性。

阈值分割法分为全局阈值分割法和局部阈值分割法，全局阈值分割法指的是使用同一个阈值对整幅图像进行分割处理，该方法适用于前景和背景的对比度比较明显的图像［15］。而局部阈值分割法指的是不同区域的目标和背景的对比度是不同的，不同区域选择不同的阈值将目标物体与背景分开。拼接后的数字PCR荧光图像被灰度处理后，图像中的阳性腔室和非阳性腔室（阴性腔室以及其他区域）之间具有不同灰度级，而且目标和背景的对比度较高，采用全局阈值分割拼接后的荧光图像较为合适。

最大类间方差法（大津法）是一种自适应的阈值分割方法，原理简单，容易实现，而且对于对比度较高的图像处理效果非常好［16］，所以本文选择该方法对图像进行阈值分割处理，分割后的结果如图3所示。

图3 二值化图像

2.2.2 形态学处理

通常，由于在制作数字PCR 芯片时，会受到加工条件，加工工艺等因素的影响，可能会导致部分腔室之间距离较小甚至粘连在一起，另外，在用生物相机拍摄荧光图像时，可能会受到相机本身或外界噪声的干扰，拍摄角度等因素的影响，最终使得荧光图像中的部分相邻腔室的荧光存在交叠，使得二值化图像中不同的目标区域形成连通区域，进而影响数字PCR荧光图像中阳性单元的统计。

数学形态学处理包含膨胀操作和腐蚀操作［17］，本文先对图像采用腐蚀操作，如图4 所示，消除了二值化图像中不同腔室之间的粘连，同时消除部分面积较小的孤立噪声点，使得接下来的处理更加简单，也进一步提高了结果的准确性。

图4 形态学处理后的图像

2.2.3 阳性腔室统计

通常，一幅图像是由很多像素构成的，连通域是指图像中具有相同像素值且位置相邻的目标像素点组成的图像区域，根据判别的邻域不同一般分为4 连通域和8 连通域［18］。经过前面一系列的处理，数字PCR 荧光图像已经被二值化，并且荧光图像中粘连的反应腔通过形态学处理也已经被分开，每一个阳性腔室分别成为单个的连通域。

连通域标记法原理简单易于实现，并且计算速度快，因此本文采用8 连通域的连通域标记法识别并标记荧光图像中的各个连通域。通过对图像中连通域的计数进而统计出连通域的个数，最终获得数字PCR 芯片荧光图像中阳性腔室的数量。为了避免较大污点以及在形态学处理时产生多余的连通域，使得最终结果产生误差影响后续分析，在标记所有的连通域之后，统计每个连通域的像素值，剔除像素较小的连通域。阳性腔室统计完成之后，根据泊松分布原理就可以计算出原始样本的模板拷贝数，最终实现核酸的精确定量。

3 实验结果分析

经过对数字PCR 芯片荧光图像的一系列操作之后，就能实现对所有阳性腔室的识别和统计，可以按照连通域扫描到的位置信息在原始图像上标记出所统计过的阳性腔室，如果标记的位置就是阳性腔室所在的位置，那就说明对阳性腔室连通域的识别是准确的。如图5 所示就是用“+”标记后的图像局部放大图，从图中可以看出，本文的处理识别方法能够准确地剔除污点，同时能够准确地区分粘连的腔室，实现了阳性腔室的精确识别。

图5 局部放大图像

为了进一步地验证本文所提出处理和统计方法的准确性，在用本文方法对荧光图像统计过后，我们通过常用的一款图像分析软件ImageJ 对同一幅荧光图像进行分析，统计出阳性腔室的数量，如图6 所示两者结果一致，表明本文采用的方法可以对数字PCR 芯片荧光图像信号的精确识别和统计。另外，在整个处理过程中，用ImageJ 处理的每一步都需要人工操作，而使用本文方法无需人工干预，操作更加简便。

图6 本文方法统计结果和ImageJ统计结果

4 结语

本文根据数字PCR芯片荧光图像的特点，提出通过连通域标记法对阳性信号进行识别和统计，首先利用SURF 算法实现荧光图像的拼接，通过灰度处理和阈值分割对图像进行二值化处理将阳性信号点从阴性区域和背景中提取出来，然后通过形态学处理把彼此粘连的阳性信号点分开，最后通过对形态学处理后的二值化图像进行连通域扫描和识别，最终实现阳性信号点的统计。实验结果表明，本文处理方法简单可靠，另外，该处理思想和方法同样可以应用于细胞计数等领域。