核桃粕纳豆发酵工艺优化及其品质分析

孙 娜，朱秀娟，何九军，谢晓娟，何红蕾

（1.陇南师范高等专科学校 农林技术学院，甘肃 陇南 742500；2.陇南特色农业生物资源研究开发中心，甘肃 陇南 742500）

纳豆（Natto）起源于中国古代，具有黏性，气味较臭，味道微甜，富含纳豆激酶、维生素、异黄酮和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等活性物质，是一种具有良好营养保健功能的优质食品资源[1-2]。纳豆激酶（Nattokinase，NK）是一种安全溶栓的天然物质，具有抑制血小板凝固的作用，其半衰期长、特异性强、副作用小、可直接口服，在预防和治疗心脑血管栓塞症等方面起到积极作用[3-4]。我国现有心血管疾病患病人数约为3.3亿人，其中血栓是引起心血管疾病人群死亡和致残的首要原因[5-6]，因此开发以纳豆激酶为核心的保健食品，扩大其临床和商业的应用是符合《国民营养计划（2017—2030）》，为改善我国居民营养状况、提高人群整体健康水平提供重要政策支撑和保障[7]。

低温核桃粕是核桃油冷榨生产工艺过程中产生的一种副产物[8-9]，具有核桃清香味，是一种良好的植物蛋白资源，蛋白质含量高达30%～40%，还富含矿物质、膳食纤维及多酚等营养物质[10]，可以为发酵菌株提供充足的氮源和碳源，因此在食品固态发酵研究中应用广泛。王宸轩等[11]以核桃粕为原料，研究了核桃粕固态发酵酱油的最佳工艺；高瑞雄等[12]以冷榨核桃粕为原料，研究了固态发酵制备纳豆激酶的最佳工艺。但目前关于低温核桃粕纳豆发酵研究还鲜有报道。

本研究以核桃粕与黄豆为原料，采用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）发酵制备核桃粕纳豆，采用单因素及响应面试验对固态发酵工艺进行优化，不仅有利于传统纳豆的风味改良和质量提升，而且为核桃粕和黄豆深加工提供了新方向，对核桃粕和黄豆资源开发和利用十分有意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

低温核桃粕：甘肃陇小南电子商务有限公司；黄豆：市售；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）：陇南师专农林技术学院实验室；尿激酶（10 000 U/mg）、凝血酶（2 000 U/mg）、纤维蛋白原（牛血）等试剂：黑龙江迪龙制药有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

7890A-5975C型气质联用仪（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）：美国安捷伦科技有限公司；UV2600紫外可见分光光度计：岛津国际贸易（上海）有限公司；LS-35L立式压力蒸汽灭菌机：山东创美机械科技有限公司；DH3600电热恒温培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 核桃粕纳豆加工工艺流程及操作要点

操作要点：选取粒径约6 mm左右的小粒黄豆和完整低温核桃饼粕，剔除有破损、霉变和虫蛀的不完整豆粒和核桃粕，用流水冲洗附着在豆皮上和核桃粕上的杂质，分别按质量比1∶3加水浸泡过夜，沥干水分。为了使核桃粕发酵充分，片状或块状核桃粕还需粉碎，过100目筛。将上述处理过的黄豆和核桃粕，分别放入发酵瓶中，于121 ℃蒸煮30 min。将枯草芽孢杆菌接种于LB液体培养基中，放置于37 ℃、170 r/min摇床培养24 h，即得发酵菌液。按照一定比例将蒸煮好的核桃粕均匀平铺于培养皿底部，上面以黄豆覆盖，冷却至40 ℃左右，接入发酵菌液，晃动培养皿使黄豆和核桃粕均匀的裹上菌液。放入培养箱发酵24 h，取出置于冰箱后熟18 h，即得成品核桃粕纳豆。

1.3.2 核桃粕纳豆发酵工艺优化单因素试验设计

通过单因素试验设计，以综合评价分为考察指标，分别考察核桃粕添加量（16%、18%、20%、22%、24%）、枯草芽孢杆菌接种量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、发酵温度（31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃、43 ℃）、发酵时间（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h）和后熟时间（12 h、16 h、20 h、24 h、28 h）对核桃粕纳豆品质的影响。

1.3.3 核桃粕纳豆发酵工艺优化响应面试验设计

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken中心组合试验设计法，以核桃粕添加量（A）、接种量（B）、发酵温度（C）和发酵时间（D）为4个考察因素，以综合评价分（Y）为响应值，设计4因素3水平响应面试验，优化核桃粕纳豆发酵工艺。响应面试验因素与水平见表1。

表1 核桃粕纳豆发酵工艺优化响应面试验因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation process optimization of walnut meal natto

1.3.4 测定方法

感官评价：由10名感官培训人员组成评价小组，对核桃粕纳豆从拉丝、气味、色泽和口感四个方面进行感官评价，并取其平均值。核桃粕纳豆感官评价标准见表2（满分100分）。

综合评价：参照付文静[13]的综合评价法，感官评分和纳豆激酶酶活两指标各占50%权重。其计算公式如下：

感官指标分析：参照SB/T 10528—2009《纳豆》[14]和T/CNLIC 0036—2021《纳豆》[15]对核桃粕纳豆进行感官分析。

核桃粕纳豆水分、蛋白质、氨基酸态氮和纳豆激酶活力的测定：参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》[16]、GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[17]、GB 5009.235—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》[18]及分光光度法[13]。

挥发性物质测定：

样品预处理：称取均匀研碎的核桃粕纳豆样品3.00 g于15 mL顶空瓶中，加入1 g NaCl和6 mL超纯水，插入已老化的固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）纤维头，在温度50 ℃，转速500 r/min的条件下预热样品15 min，将萃取头插入进样口于250 ℃解吸3 min。

GC条件：载气为氦气（He），流速1.0 mL/min，不分流进样；气化室温度250 ℃；传输线温度280 ℃；升温程序：初始温度40 ℃，恒温2 min，以5 ℃/min的升温速率升高到150 ℃，再以10 ℃/min的速度升至260 ℃，保持5 min[19-20]。

定性定量方法：对检测出的成分采用美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）11数据库自动检索化合物的质谱数据，参考标准光谱图进行定性分析；采用面积归一化法定量。

1.3.5 数据统计与分析

采用Microsoft office Excel 2016软件和Design Expert 10软件对数据进行分析处理，每组试验平行测定3 次。

2 结果与分析

2.1 核桃粕纳豆发酵工艺优化单因素试验结果

2.1.1 核桃粕添加量对纳豆品质的影响

由图1可知，随低温核桃粕添加量的增加，核桃粕纳豆综合评价分呈先升高后降低的趋势。当核桃粕添加量为20%时，综合评价达到最大值，为81.3分。这可能是因为随着核桃粕添加量的不断增加，核桃粕特有的清香味，在一定程度上提升了纳豆的感官品质；但当核桃粕添加量过高时，因其颗粒度较小，会附着在黄豆表面，减少枯草芽孢杆菌与黄豆的直接接触，导致纳豆激酶活力降低。因此，选择最佳核桃粕添加量为20%。

图1 核桃粕添加量对核桃粕纳豆品质的影响Fig.1 Effect of walnut meal addition on the quality of walnut meal natto

2.1.2 枯草芽孢杆菌接种量对纳豆品质的影响

由图2可知，随枯草芽孢杆菌接种量的增加，核桃粕纳豆综合评价分呈先升高后缓慢降低的趋势。当接种量＜1%时，核桃粕纳豆表面附着的白膜少、拉丝短，纳豆激酶酶活低，这可能是因为接种量不足导致底物发酵不彻底造成的；当接种量为1%时，纳豆表面附着的白膜增多、拉丝变长，纳豆激酶酶活也显著增高，综合评价达到最大值，为80.3分；当接种量＞1%时，随着接种量的增加，纳豆表面附着的白膜不再增多，拉丝不再变长，且纳豆表面失水出现褶皱现象，导致纳豆感官品质下降，这可能是因为接种量越高，枯草芽孢杆菌繁殖越快，底物消耗力度大，发酵时间就会缩短，枯草芽孢杆菌生长到一定阶段，菌体原生质失水形成椭圆形倒柱状的内生孢子，出现褶皱现象。因此，选择最佳枯草芽孢杆菌接种量为1%。

红军在雪山草地筹粮过程中，先后采取了一系列的措施。一、号召节约粮食，严格拟定粮食分配计划；加紧粮食宣传工作，动员群众将自己的粮食和食物支援红军。二、缴获战利品。三、通过苏维埃政府没收劣绅、地主的粮食。四、向商人和当地群众购买粮食。五、运走藏匿在老百姓家的粮食和窖藏，留下银元或欠条，收割地里成熟的青稞、小麦等，插上木板借条。

图2 枯草芽孢杆菌接种量对核桃粕纳豆品质的影响Fig.2 Effect of Bacillus subtilis inoculum on the quality of walnut meal natto

2.1.3 发酵温度对纳豆品质的影响

由图3可知，随发酵温度的升高，核桃粕纳豆综合评价分呈先升高后降低的趋势。随着发酵温度的不断提高，纳豆表面附着的白膜逐渐增多，纳豆激酶活力不断升高；当发酵温度达到40 ℃时，综合评价分达到最大值，为96.0分；继续升高发酵温度，纳豆表面附着的白膜不再增多反而减少，纳豆激酶活力也开始下降。这可能是因为在适宜的温度条件下，枯草芽孢杆菌生长旺盛，利于纳豆发酵。当发酵温度过低或过高时，都会影响枯草芽孢杆菌的生长繁殖[22]。因此，选择最佳发酵温度为40 ℃。

图3 发酵温度对核桃粕纳豆品质的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on the quality of walnut meal natto

2.1.4 发酵时间对纳豆品质的影响

由图4可知，随着发酵时间的延长，核桃粕纳豆综合评价分呈先升高后降低的趋势。当发酵时间为24 h时，综合评价分达到最大值，为96.0分。当发酵时间较短时，枯草芽孢杆菌活菌数不足，纳豆表面白膜较少，纳豆激酶活力低，发酵不充分；当发酵时间过长时，营养物质减少，环境的载菌量不足以承受较多的芽孢，枯草芽孢杆菌菌体逐渐进入衰亡期，亦不利于发酵[23]。因此，选择最佳发酵时间为24 h。

图4 发酵时间对核桃粕纳豆品质的影响Fig.4 Effect of fermentation time on the quality of walnut meal natto

2.1.5 后熟时间对纳豆品质的影响

由图5可知，随着后熟时间的延长，核桃粕纳豆综合评价分呈先上升后缓慢下降的趋势。当后熟时间为20 h时，综合评价分达到最大值，为90.5分。这可能是因为纳豆激酶极不稳定，会随着后熟时间的延长发生转化或降解；亦或是后熟过程中产生了特殊的活性物质，对纳豆激酶的活性产生了抑制作用所致[24]。因此，选择最佳后熟时间为20 h。

图5 后熟时间对核桃粕纳豆品质的影响Fig.5 Effect of post ripening time on the quality of walnut meal natto

2.2 核桃粕纳豆发酵工艺优化响应面试验结果

2.2.1 响应面试验设计及结果

根据单因素试验结果分析，运用Box-Behnken响应面优化方法，对表3试验数据进行多元非线性拟合，拟合回归方程为：

表3 核桃粕纳豆发酵工艺优化响应面试验结果与分析Table 3 Results and analysis of response surface tests for fermentation process optimization of walnut meal natto

2.2.2 回归模型方差分析

由表4可知，模型F值为23.35，P值＜0.000 1，模型极显著，失拟项（P=0.075 1＞0.05）不显著，说明模型选择准确。决定系数R2=0.958 9，调整决定系数R2Adj=0.917 9，说明此模型和实际实验拟合较好。预测的核桃粕纳豆最佳发酵工艺为核桃粕添加量20.5%、接种量1.2%、发酵温度40.9 ℃、发酵时间27 h和后熟时间20 h。此条件下的核桃粕纳豆综合评价预测值为95.0分。在此条件下进行3次平行验证试验，试验测得综合评价实际值为94.3分，二者数值接近，说明模型预测所得最佳发酵工艺可用于核桃粕纳豆实际生产。

表4 Box-Benhnken试验结果方差分析Table 4 Variance analysis of Box-Benhnken tests results

2.2.3 响应面分析

对核桃粕添加量（A）、接种量（B）、发酵温度（C）和发酵时间（D）4个因素两两作交互作用分析，对其作响应曲面及等高线，结果见图6。响应曲面越陡峭，说明影响越显著；曲面越平坦，说明影响越小[25-27]。由图6可知，核桃粕添加量与发酵温度之间（AC）、发酵温度与发酵时间（CD）之间的交互作用强，响应曲面呈凸形，抛物面更陡峭。

图6 各因素间交互作用对核桃粕纳豆综合品质影响的响应曲面及等高线Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on the comprehensive quality of walnut meal natto

2.3 产品品质分析

2.3.1 感官指标分析

依据SB/T 10528—2009《纳豆》和T/CNLIC 0036—2021《纳豆》感官要求对产品进行检验，结果表明核桃粕纳豆色泽呈茶褐色，表面均匀覆盖一层白色菌膜，具有纳豆特有气味，搅拌时有黏性强，拉丝长，且豆粒完整，软硬适当。

2.3.2 理化指标分析

由表5可知，各项理化指标均符合纳豆商业标准要求。

表5 核桃粕纳豆理化指标检测结果Table 5 Physicochemical indexes determination results of walnut meal natto

2.3.3 挥发性物质测定

由表6可知，核桃粕纳豆由HS-SPME-GC-MS分析鉴定出的挥发性物质主要有烃类22种（24.8%）、醇类9种（36.0%）、酯类8种（36.0%）、醚类1种（1.9%）、酮类1种（0.7%）、杂环化合物2种（0.6%）。上述挥发性物质共同构成了核桃粕纳豆独特的风味。核桃粕纳豆中主要的挥发性风味物质有2-氨基苯甲酸-3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇酯（31.3%）、芳樟醇（19.5%）、4-萜烯醇（9.1%）、石竹烯（4.4%）等。2-氨基苯甲酸-3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇酯属于酯类化合物，具有花椒油的气味[28]；芳樟醇属于链状萜烯醇类，具有铃兰特征的花香气味[29]；4-萜烯醇属于天然单萜类化合物，具有较淡的泥土香和陈腐的木材气味[30]；石竹烯属于双环倍半萜类化合物，具有辛香、木香、柑橘香、樟脑香及温和的丁香香气[31]。与传统纳豆风味相比，川芎嗪（0.34%）等具有特殊异臭味的挥发性物质相对减少[32]，核桃粕与黄豆共发酵起到了改善不良风味的作用，这可能是因为核桃粕原料本身或二者共发酵相互作用所致。

表6 核桃粕纳豆挥发性物质分析Table 6 Analysis of volatile substances in walnut meal natto

3 结论

以核桃粕和黄豆为原料，选取枯草芽孢杆菌为发酵菌种制备核桃粕纳豆。采用单因素和Box-Behnken试验得到最佳发酵工艺条件为核桃粕添加量20.5%、接种量1.2%、发酵温度40.9 ℃、发酵时间27 h和后熟时间20 h。在此条件下，发酵所得纳豆呈茶褐色，拉丝长，氨味低，纳豆激酶活力高。通过HS-SPME-GC-MS分析核桃粕纳豆挥发性物质成分，结果表明，核桃粕纳豆主要成分为2-氨基苯甲酸-3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇酯（31.3%）、芳樟醇（19.5%）、4-萜烯醇（9.1%）、石竹烯（4.4%）等，这些化合物共同赋予核桃粕纳豆独特风味，与传统纳豆风味相比，川芎嗪（0.34%）等具有特殊异臭味的挥发性物质也相对减少。本研究在保留纳豆营养价值的基础上，降低了氨臭味，对核桃粕纳豆的工业化生产可以提供一定的参考依据。