miR-10b靶向IGF-1R调控乳腺癌合并2型糖尿病患者癌细胞的增殖和转移

杨 欣, 穆 飞, 尼加提·塔西甫拉提, 哈依纳尔·卡克赞, 郭晨明

(新疆医科大学第一附属医院昌吉分院甲状腺乳腺外科, 新疆 昌吉 831100)

乳腺癌在全球新发肿瘤中排第一位,2020年已有超过230万的新确诊病例。近年来中国女性乳腺癌发病率显著增高,死亡率约为6.9%[1],高达15%的乳腺癌患者患有2型糖尿病[2]。与乳腺癌不合并2型糖尿病患者相比,乳腺癌合并2型糖尿病患者的总生存期更差[3]。流行病学研究表明,2型糖尿病与恶性肿瘤的高发病率之间存在相关性,特别是乳腺癌(风险约增加1.2～1.5倍)[4],两者均有肥胖、吸烟、饮酒、饮食等共同的易感因素[5]。研究指出,2型糖尿病与乳腺癌的关联可能与多种原因有关,包括高血糖、胰岛素信号通路、胰岛素样生长因子1(IGF-1)信号通路和内源性性激素的调节[6-7],但具体机制仍有待深入研究。

微小RNA(miRNA)是由大约22个核苷酸结构组成的非编码单链RNA。一个miRNA可直接或间接靶向调控数百个mRNA,形成一个复杂的miRNA-mRNA网络,以调节细胞过程[8]。Ma等[9]的研究发现,在转移性乳腺癌细胞中miR-10b过表达与肿瘤的迁移与侵袭相关。另一项研究显示,miR-10b与乳腺肿瘤发生脑转移呈正相关[10]。然而,miR-10b在乳腺癌合并2型糖尿病患者中的具体作用机制尚不明确。本研究分析乳腺癌合并2型糖尿病患者的组织样本,进一步探讨miR-10b在乳腺癌合并2型糖尿病患者中调节胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)信号通路中的作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2017年7月-2019年12月新疆医科大学第一附属医院乳腺外科26例合并2型糖尿病的乳腺癌女性患者(病例组)癌组织及相关的临床病理资料,对照组样本为相应的癌旁组织。所有新鲜乳腺组织都是一份病理包埋,一份迅速转入液氮中,-80℃储存备用。本研究经新疆医科大学第一附属医院伦理委员会审批(审批号:201112013RXW),并获得所有受试者的书面知情同意。

1.2 试剂与仪器HEK293T细胞、MCF-7细胞(武汉普诺塞公司);MEM、胎牛血清、胰蛋白酶、磷酸缓冲液、青霉素、链霉素、嘌呤霉素(美国Gibco公司)。逆转录试剂盒(miScript II RT Kit50)、PCR试剂盒(QuantiNova SYBR Green PCR Kit500、miScript SYBR Green PCR Kit200)均购于美国Qiagen公司;PCR试剂盒TRIzol(美国Invitrogen公司);PCR引物(北京天根生化科技有限公司);磷酸酶抑制剂混合物(HaltTMPhosphatase Inhibitor Cocktail)BCA法蛋白浓度检测试剂盒(上海碧云天生物技术公司);MTT试剂盒(上海泽叶生物科技有限公司);抗IGF-1R抗体和二抗(英国Abcam公司);荧光素酶报告载体[pGL3-IGF-1R-3′UTR野生型(Wt)、pGL3-IGF-1R-3′UTR突变型(Mut)和pGL3-IGF-1R-3′UTR空载型(NC)]购自上海吉凯基因科技有限公司。图像采集系统(Leica DM3000),荧光定量PCR仪(Bio-Rad CFX96),电泳仪(Bio-RadPowerPac HC),凝胶成像仪(Bio-RadChemiDoc MP),超低温冰箱(Thermo Forma 995),Dual-Luciferase®报告分析系统(Promega E1910)。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养与分组 从癌症细胞系百科全书(Cancer cell line encyclopedia,CCLE)数据集(https://portals.broadinstitute.org/ccle/about)获得乳腺肿瘤的常用细胞miRNA表达矩阵。在乳腺恶性肿瘤常用细胞中,发现MCF-7细胞中miR-10b表达水平最高,因此选取MCF-7细胞用于后续试验。细胞在含有10%胎牛血清的MEM培养基中培养,置于恒温培养箱中(37℃、5%CO2),隔天换液1次,待细胞生长至80%密度时传代培养。细胞分为normal组(不做转染)、miR-10b-mimic组(转染空载病毒)、miR-10b-inhibitors组(转染miR-10b抑制剂),按照分组名称进行慢病毒转染。

1.3.2 细胞增殖能力检测 取5×103细胞/孔种植于96孔培养皿上,在37℃,5%CO2下生长8 h,去上清,用新鲜培养基代替,添加25 μL MTT溶液(5 mg/mL),37℃下孵育4 h,去上清,向每孔中加入100 μL二甲基亚砜。用旋转振动筛剧烈搅拌30 min。用5.5 mmol/L、25 mmol/L和50 mmol/L葡萄糖分别刺激人MCF-7细胞8 h、24 h、48 h、72 h、96 h和120 h。用酶标仪测量595 nm处的吸光度。

1.3.3 细胞凋亡检测 将每组制备的单细胞悬浮液离心,抽吸上清液。加入缓冲液,重悬细胞,将细胞浓度调整为1×106细胞/mL。按照Annexin V-FITC-PI试剂盒说明书进行染色,流式细胞术检测凋亡细胞比例。

1.3.4 细胞迁移能力检测 转染后用胰蛋白酶消化细胞,悬浮于无血清培养基中,将细胞悬液加入铺好基质胶的上室,将含20%胎牛血清的600 μL培养液加入下室。常规培养24 h后,擦去表面基质胶和上室内的细胞。结晶紫染色24 h后计算上腔室迁移细胞的体积。

1.3.5 qRT-PCR 按照TRIzol试剂说明书从病例组和对照组乳腺组织中分离总RNA,利用分光光度仪对总RNA的纯度及浓度进行检测。实施反转录后检测miR-10b和IGF-1R的含量。引物序列如下: Hsa-miR-10b-5P, UACCCUGUAGAACCGA-AUUUGUG;U6,CGCTTCGGCAGCACATATAC;microRNA的另一条引物为通用引物。IGF-1R上游引物,CCGCTGCCAGAAAATGTGCCCA;下游引物,TGTCGTTGTCAGGCGCGCTG;GAPDH上游引物,GCACCGTCAAGGCTGAGAAC;下游引物,TGGTGAAGACGCCAGTGGA。本实验miR-10b以U6为内参基因,IGF-1R以GAPDH为内参基因。采用2-△△Ct法测定基因的相对表达水平。

1.3.6 Western-blot检测IGF-1R蛋白 取MCF-7细胞用液氮研磨后加入磷酸酶抑制剂混合物和RIPA裂解液进行蛋白裂解,离心,获取组织蛋白,采用BCA比色法计算蛋白浓度。蛋白样品采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离,转移到聚偏氟乙烯膜上,用5%脱脂牛奶密封2 h后与稀释后的一抗IGF-1R(1∶1 000)和GAPDH(1∶10 000)在4℃摇床孵育过夜,室温下TBST洗涤5次×5 min,随后用稀释AP标记的对应二抗(1∶2 000)在摇床上室温孵育2 h,用TBST洗涤5次×5 min,用AP-NBT/BICP显色法检测,用Image J对图像进行灰度分析。

1.3.7 荧光素酶报告基因实验 将HEK293T细胞种植在24孔生长板上,与pGL3-IGF-1R-3′UTR Wt或pGL3-IGF-1R-3′UTR Mut共转染,并转染miR-10b质粒及匹配空载质粒。转染后继续培养48 h,通过Dual-Luciferase®报告分析系统评估荧光素酶活性。

1.3.8 免疫组织化学 组织常规石蜡包埋制成切片。将50 μL的抗体加入切片,室温下接种30 min,用PBS冲洗,取连续切片,二甲苯脱蜡、乙醇梯度脱水、抗原修复、山羊血清封闭后加入IGF-1R抗体,37℃孵育10～15 min,DAB显色、复染、脱水、透明、封片。采用Image J软件对各组免疫组化切片进行半定量分析,在200×倍镜下,阳性细胞可被染成棕黄色颗粒。

2 结果

2.1 病例组和对照组乳腺组织中miR-10b与IGF-1R表达水平比较与对照组相比,病例组乳腺癌组织中可见大量具有细胞异型性的肿瘤细胞。与对照组相比,病例组乳腺癌组织中IGF-1R表达水平显著降低,miR-10b表达水平显著升高,差异均有统计学意义(P<0.01～0.05)(图1)。

注: A, 病例组与对照组乳腺组织HE染色; B, 病例组与对照组乳腺组织中miR-10b的表达水平; C, 病例组与对照组乳腺组织免疫组化结果; D, 病例组与对照组乳腺组织中IGF-1R的表达水平;与对照组比较, *P<0.05, **P<0.01。

2.2 不同葡萄糖浓度刺激对MCF-7细胞增殖的影响25 mmol/L葡萄糖浓度刺激下,MCF-7细胞增殖能力明显增加;50 mmol/L葡萄糖浓度刺激下细胞的增殖能力低于5.5 mmol/L和25 mmol/L葡萄糖浓度刺激(图2A)。miR-10b抑制剂转染中MCF-7细胞的增殖能力随着葡萄糖浓度的增加而降低(图2B)。因此,以25 mmol/L葡萄糖浓度作为高糖环境进行后续实验。

注: A, 不同葡萄糖浓度和时间对MCF-7细胞增殖的影响; B, 不同葡萄糖浓度和时间对miR-10b抑制剂转染中MCF-7细胞增殖的影响; *P<0.05; **P<0.01。

2.3 miR-10b对MCF-7细胞凋亡的影响与normal组比较,25 mmol/L葡萄糖浓度下miR-10b-inhibitors组MCF-7细胞凋亡率升高,差异有统计学意义(P<0.05);与miR-10b-mimic组比较,25 mmol/L葡萄糖浓度下miR-10b-inhibitors组MCF-7细胞凋亡率明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)(图3)。

注: A和B, 25 mmol/L葡萄糖浓度下转染不同质粒的MCF-7细胞的细胞流式图; C, 细胞凋亡检测结果; 与normal组比较, *P<0.05; 与miR-10b-mimic组比较, **P<0.01。

2.4 miR-10b对MCF-7细胞迁移的影响25 mmol/L葡萄糖浓度下,与miR-10b-mimic组比较,miR-10b-inhibitors组MCF-7细胞数量减少,迁移能力降低,差异具有统计学意义(P<0.001)(图4)。

注:与miR-10b-mimic组比较, ***P<0.001。

2.5 不同葡萄糖浓度刺激对MCF-7细胞中IGF-1R表达的影响25 mmol/L葡萄糖浓度下,miR-10b-inhibitors组中IGF-1R mRNA和蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)(图5)。

2.6 miR-10b的靶点分析与miR-10b-mimic组比较,在miR-10b-inhibitors组中pGL3-IGF-1R-3′UTR Wt的荧光素酶活性被显著抑制(P<0.05),而pGL3-IGF-1R-3′UTR Mut的荧光素酶活性未受影响(P>0.05)(图6、表1)。

表1 miR-10b靶基因预测和荧光素酶测定数据

注: 与miR-10b-mimic组比较, *P<0.05。

3 讨论

乳腺癌是女性中发病率最高的一种恶性肿瘤,发生转移是患者治疗失败和死亡的主要原因。miRNAs是一类小分子非编码调控RNA,在乳腺癌中发挥着致癌基因或抑癌基因的作用。研究发现miRNA-10b在晚期及转移性乳腺癌组织中过表达,可能与乳腺癌的转移密切相关[11]。Tahiri等[12]研究发现miRNA-10b在晚期乳腺癌中高表达,可作为早期乳腺癌转移的特征分子标志物。Ma等[9]的研究发现,miRNA-155、miRNA-9a和miRNA-10b在乳腺癌细胞中高表达,而只有miRNA-10b在转移性乳腺癌细胞中有特异性高表达。

流行病学调查资料显示,女性糖尿病患者患乳腺癌的风险率比单纯患乳腺癌女性高20%,且以2型糖尿病为主[13],江燕丽等[14]研究发现合并糖尿病的乳腺癌患者淋巴结3枚以上转移率为33.3%,高于无糖尿病的乳腺癌患者的12.0%,合并糖尿病的乳腺癌患者Ⅲ级肿瘤浸润率为46.7%,高于无糖尿病的乳腺癌患者的22.7%。以上结果提示糖尿病会增加乳腺癌的发病,并且能促进乳腺癌的浸润转移,尽管糖尿病-癌症的流行病学关系已经被熟知,但联系这些疾病的机制尚不明确。糖尿病存在胰岛素抵抗和葡萄糖清除减少,同时产生干扰胰岛素信号传导的细胞因子,而胰岛素样生长因子1型(IGF-1)信号通路就成了糖尿病和癌症的病理生理过程的主要调控因子。有研究报道约75%的乳腺癌患者的组织或细胞中胰岛素/IGF-1R信号通路被显著激活[15]。本研究结果显示,相较于癌旁组织,IGF-1R在合并2型糖尿病的乳腺癌患者的癌组织中的表达反而降低。Hou等[16]报道MicroRNA-10b通过直接靶向IGF-1R来抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭,提示IGF-1R的表达水平与miR-10b的表达可能相关。有研究报道miR-10b表达提高了膀胱癌、鼻咽癌和胃癌细胞的迁移和侵袭能力[17-19]。研究发现,miR-10b表达的恢复增强了肝细胞癌的增殖、迁移和侵袭[20-21]。为了进一步证明miR-10b在合并2型糖尿病的乳腺癌患者中如何调控IGF-1R,进而影响乳腺癌细胞增殖和侵袭能力,本研究通过荧光素酶报告基因实验验证,结果表明miR-10b与IGF-1R存在直接靶向调控关系,并采用体外实验,利用高含量葡萄糖培养乳腺癌细胞来模拟合并2型糖尿病的乳腺癌体内环境。建立了稳定转染miR-10b抑制剂(miR-10b-inhibitors组)和转染空载病毒(miR-10b-mimic组)的细胞。结果显示,miR-10b-inhibitors组在25 mmol/L浓度的葡萄糖培养条件下,乳腺癌细胞中IGF-1R的含量上升,MCF-7细胞增殖能力下降,细胞垂直迁移能力下降,凋亡增加。表明在高糖环境下,miR-10b直接靶向IGF-1R促进了乳腺癌细胞的生长和迁移。

综上所述,在高糖环境中靶向抑制乳腺癌细胞miR-10b的表达,会促进IGF-1R的表达从而使得乳腺癌细胞增殖被抑制,凋亡增加,侵袭能力下降,miR-10b具有靶向IGF-1R调控高糖环境下乳腺癌细胞的增殖和转移,为研究糖尿病和癌症之间的作用机制提供新的思路。