5种芽孢杆菌对水体中无机磷的去除效果

李文敏　关阔　李国强　殷蕊　宫春光

摘 要：在蒸馏水+ KH2PO4的环境条件下进行了地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、凝结芽孢杆菌（B. coagulans）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）和胶冻样类芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginosus）对水中无机磷的去除效果研究，结果表明，地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌基本不具备除磷能力，解淀粉芽孢杆菌和胶冻样类芽孢杆菌有一定除磷能力且除磷效果相近，均是从104 CFU/mL开始随着菌液浓度的增加，除磷效果逐步提高，在107 CFU/mL浓度组达到最佳除磷效果；同时除磷效果与水力停留期间随时间的演化规律相似，都是在处理6 h时基本达到最佳除磷效果，而6～8 h期间除磷效果明显降低。

关键词：无机磷；解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）；胶冻样类芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginosus）；除磷

芽孢杆菌是一类革兰氏阳性菌，在水产养殖中，多用来调节肠道内微生态菌群平衡[1]、促进水产动物的生长、防控水产动物病害和改善养殖水质。已有的研究结果表明，多种芽孢杆菌具有分解水体有机质、降氮[2-3]、降硫[4]、降磷[5-7]的作用。虽然目前我国尚无养殖尾水排放的统一标准，但参考某些已发布或正在征求意见的地方标准，磷都是水产养殖尾水排放中的一个重要监测指标，例如，山东省《海水养殖尾水排放标准》征求意见稿中，将总磷的指标限定为0.2～0.3 mg/L；江苏省在已发布《池塘养殖尾水排放标准》中将淡水养殖尾水中总磷的指标限定为0.4～0.8 mg/L，海水养殖尾水中总磷的指标限定为0.5～1.0 mg/L[8]。本试验通过对水产养殖中常用的5种芽孢杆菌的除磷效果研究，力求找到适宜的除磷添加浓度和水力停留期间除磷效果与时间的演化规律，以为更好地设计水产养殖尾水处理方案提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取的5种芽孢杆菌来自河北农业大学海洋学院病害防控实验室，分别为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、凝结芽孢杆菌（B. coagulans）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）和胶冻样类芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginosus）。KH2PO4为分析纯。

主要实验仪器有高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、生化培养箱、恒温培养箱、烘箱、麦氏比浊仪、分析天平（万分之一）、容量瓶、移液枪、离心管、锥形瓶、TP-1A型多参数水质分析仪等。

1.2 试验方法

含磷水样配制：KH2PO4经105 ℃烘干2 h后用蒸馏水溶解、定容，配制成浓度为0.5 mg/L的无机磷水样，装入100 mL锥形瓶中。

菌种活化：分别称取1 g的各种芽孢杆菌干品，蒸馏水溶解，涂布到LB固体培养基上，生化培养箱中28 ℃活化培养24 h；再次接种到LB固体和液体培养基上，固体培养基生化培养箱28 ℃再次培养24 h，液体培养基摇床28 ℃培养24 h。

菌液配制：挑取菌落，蒸馏水溶解，比浊仪测定麦氏浊度，计算出5种芽孢杆菌菌液的浓度，按10倍稀释法稀释混匀，配制成104、105、106、107 CFU /mL和108 CFU /mL浓度梯度。

将浓度为108 CFU /mL的5种芽孢杆菌菌液摇匀后用移液枪吸取1 mL菌液分别加入锥形瓶中，对照瓶加1 mL 0.9%生理盐水，分别于2、4、6、8 h后测定水样中的无机磷含量。每个浓度菌液设3个平行，结果取平均数。

重复上述操作，测定加入其他4种浓度梯度菌液后水样中的无机磷含量。

本次试验加入各种浓度菌液经100 mL蒸馏水稀释后的最终菌液浓度为102、103、104、106 CFU /mL和106 CFU /mL。

2 结果与分析

2.1 试验结果

不同浓度的5种芽孢杆菌在2、4、6 h和8 h对无机磷的去除效果见表1—表5。

2.2 分析

从试验结果可以看出，5种芽孢杆菌中，解淀粉芽孢杆菌和胶冻样类芽孢杆菌具有一定除磷作用，而地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的除磷效果非常差，基本不具备除磷能力。解淀粉芽孢杆菌和胶冻样类芽孢杆菌的除磷效果相近，没有明显区别，均是从104  CFU/mL开始随着菌液浓度的增加，除磷效果逐步提高，在107 CFU/mL浓度组达到最佳除磷效果；而108 CFU/mL浓度组的除磷效果有所下降，推测可能与它们的次生代谢产物有关。解淀粉芽孢杆菌和胶冻样类芽孢杆菌的除磷效果与水力停留期间随时间的演化规律相似，都是在处理6 h时基本达到最佳除磷效果，随后到8 h时除磷效果明显降低。解淀粉芽孢杆菌和胶冻样类芽孢杆菌在107 CFU/mL浓度组8 h时，均将无机磷的浓度从0.5 mg/L降低到0.19 mg/L，以目前已发布的各省地方标准看，已达到最严格的限定要求。

本次试验是在实验室中使用蒸馏水完成的，试验环境相对洁净，条件单一，试验结果只能简单验证解淀粉芽孢杆菌和胶冻样类芽孢杆菌具有一定除磷效果，而水产养殖中的水环境则明显不同，其由多种微生物构成的微生态系统极为复杂且变化多端，某种细菌的繁衍增殖受多因素的影响，因此，如何能够在生产中更好地利用微生态制剂对养殖尾水中的磷进行有效降解尚需要进一步研究。

参考文献：

[1] 刘文斌，尹君，方星星，等.3种益生素配伍对异育银鲫生长、消化及肠道菌群组成的影響[J].海洋与湖沼，2007，38（1）：29-35.

[2] 高超.芽孢桿菌对草鱼养殖水质的调控作用[J].黑龙江水产，2022，41（6）：22-25.

[3] JIANG L L， WANG K Y， WU Y G， et al. Application of bio-organic fertilizer containing high-efficient nitrogen-fixing Bacillus amyloliquefaciens on strawberry[J]. Agricultural Biotechnology（English）， 2019，8（1）：121-125.

[4] 姬妍茹，刘宇峰，高媛，等.高效脱硫诱变菌株降硫性能的研究[J].生物技术，2012，22（6）：64-67.

[5] 张爱民，李乃康，赵钢勇，等.土壤中解磷、解钾微生物研究进展[J].2015，35（4）：442-448.

[6] SMOLDERS G J F，VAN DER MEIJ J，VAN LOOSDRECHT M C M，et al. Model of the anaerobic metabolism of the biological phosphorus removal process-stoichiometry and pH influence[J].Biotechnology Bioengineer，1994，43：461-470.

[7] DARREN S.The phosphorus composition of a diverse series of Australian sediments[J].Hydrobiologia，1996，335：63-73.

[8] 江苏省生态环境厅，江苏省市场监督管理局.池塘养殖尾水排放标准：DB 32/4043-2021[S]. 2021：1-3.

Studies on the removal of five Bacillus spp. on inorganic phosphorus in water

LI Wenmin1， GUAN Kuo2， LI Guoqiang1， YIN Rui3， GONG Chunguang4

（1. Cangzhou municipal Aquatic Technology Promotion Station，Cangzhou 061000，China; 2. Chengde municipal Aquatic Technology Promotion Station，Chengde 067000，China; 3. Hebei Academy of Ocean and Fishery Sciences，Qinhuangdao 066200，China; 4. Ocean college of Hebei Agriculture University， Qinhuangdao 066003，China）

Abstract：The removal effect of Bacillus licheniformis， B. coagulans， B. subtilis， B. amyloliquefaciens and Paenibacillus mucilaginosus on inorganic phosphorus in water was studied under the environment of distilled water + KH2PO4. The results showed that B. licheniformis， B. coagulans and B. subtilis basically could not remove phosphorus， while B. amyloliquefaciens and Paenibacillus mucilaginosus have certain phosphorus removal ability and similar phosphorus removal effect. With the concentration increased from 104 CFU/mL onwards， the phosphorus removal effect gradually increased， and the best phosphorus removal effect was achieved at 107 CFU/mL group; meanwhile， their phosphorus removal effect to the evolution law of hydraulic retention period over time was similar， both reaching the max phosphorus removal at 6 h after treatment， while the phosphorus removal effect significantly decreased during 6-8 h.

Key words：inorganic phosphorus; Bacillus amyloliquefaciens; Paenibacilli mucilaginosus; phosphorus removal

（收稿日期：2023-06-24）