复合酶法提取鱼腥草中黄酮类化合物研究

孙 琛 靳雅楠 李 婷 高学琴 李培然 冯玉冰 孙金旭

（1 衡水市综合检验检测中心 河北 衡水 053000； 2 衡水学院 河北 衡水 053000）

鱼腥草为三白草科蕺菜属植物，因草带有鱼腥味而得名[1～2]，在我国四川、贵州、云南等地栽培较多，被国家卫健委批准为药食同源中药品种，在多种食品、药品中被广泛应用。鱼腥草中的成分主要为有机酸、挥发油、黄酮类化合物，其中黄酮类化合物无论是从种类还是含量都比较丰富，传统中医中药主要应用鱼腥草治疗慢性呼吸道疾病、支气管炎、肺炎等，现代研究表明，鱼腥草及其提取物对非典型肺炎、肥胖症、癌症、糖尿病、皮肤病等均有治疗效果[3]。

复合酶法提取中药中有效活性成分，需要将细胞中的活性物质释放到提取的溶液中，为去除阻碍，先需要对植物细胞进行破壁处理[4～8]。组成植物细胞壁的成分多为木质素、果胶质、半纤维素、纤维素等，可以采用生物酶降解技术，或利用纤维素酶、果胶酶，它们能够破坏细胞壁致密结构，改变通透性，使活性物质从细胞内扩散到提取溶液中，从而使活性成分最大限度地被提取出来。与其它提取方法相比，复合酶提取法具有高效、工艺简单、无有害残留等特点，因此这种方法提取活性成分潜力巨大[9]。

1 材料与方法

1.1 材料。鱼腥草(购于北京同仁堂衡水分店)经清洗后烘干，粉碎机粉碎后过80 目筛；芦丁标准品(购于国家标准物质网)；植物提取海藻肥纤维素酶(活力单位10000U/g，南宁东恒华道生物科技有限责任公司)；果胶酶(活力单位100000U/g，江苏东聚生物科技有限公司)。

1.2 仪器设备。破壁机(深圳市净品环保科技有限公司)；电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；分光光度计(722G 可见分光光度计，广州广一科学仪器有限公司)。

1.3 黄酮测定方法。黄酮测定法参考李志清《发酵法对比提取丹参黄酮研究》[10]。

2 结果与分析

2.1 复合酶配比对鱼腥草黄酮提取影响研究。鱼腥草黄酮提取过程中，复合酶添加量按2 g/L 添加，纤维素酶和果胶酶分别按10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7 的比例进行添加，鱼腥草料液比例3∶7，提取温度自然，提取时间4 h，研究不同酶配比对鱼腥草黄酮提取的影响，结果如图1 所示。纤维素酶和果胶酶对植物细胞壁的分解破坏途径不同，但并不是越多越好，需要考虑二者之间的恰当比例，只有二者添加比例合适，才能更有效地发挥作用。由图1 可知，当开始只添加纤维素酶时，提取效果不是很好，随着果胶酶的添加，提取量开始增大，当纤维素酶和果胶酶添加比例为7∶3 时，鱼腥草黄酮的提取量最大，之后随着果胶酶添加量的增加，鱼腥草黄酮提取量呈下降趋势，说明纤维素酶和果胶酶添加比例以7∶3 较为适宜。

图1 复合酶配比对鱼腥草黄酮提取影响

2.2 复合酶添加量对鱼腥草黄酮提取的影响。在研究纤维素酶复合果胶酶配比对鱼腥草黄酮提取量影响的基础上，研究复合酶添加量对鱼腥草黄酮提取量的影响，复合酶添加量分别设定为1 g/L、1.5 g/L、2 g/L、2.5g/L、3g/L、3.5g/L、4g/L，温度自然，提取时间4 h，纤维素酶和果胶酶添加比例设定为7∶3，提取结束后测定鱼腥草黄酮提取量，结果如图2 所示。一定量的复合酶才能更好地发挥分离提取的效果，复合酶添加量低，影响提取效率，复合酶添加量高，增加提取成本。由图2 可知，随着复合酶添加量的增加，鱼腥草黄酮提取量增大，添加量为3g/L时，鱼腥草黄酮提取量达到最高，之后随复合酶添加量的增加，鱼腥草黄酮提取量变化不明显，因此，确定复合酶添加量为3g/L。

图2 复合酶添加量对鱼腥草黄酮提取影响

2.3 酶解温度对鱼腥草黄酮提取的影响。在一定范围内，酶活力和温度呈现一定的相关性，高温能激发酶的活性，温度太高，酶的活性会钝化，每种酶都有自己适宜的活力温度范围，酶解提取鱼腥草黄酮过程中，复合酶比例为7∶3，复合酶添加量3 g/L，酶解时间4 h，分别设定不同酶解温度进行提取，结果如图3 所示。由图3 可知，复合酶分解提取鱼腥草黄酮，提取量和酶解温度很相关，随着酶解温度的升高，鱼腥草黄酮提取量迅速增加，且增加幅度很大，当提取温度为50 ℃时，鱼腥草黄酮提取量最高，之后，随温度升高，迅速降低，表明酶活性钝化。

图3 酶解温度对鱼腥草黄酮的提取影响

2.4 酶解时间对鱼腥草黄酮提取的影响。研究不同酶解时间对鱼腥草黄酮提取的影响，复合酶比例为7∶3，复合酶添加量3 g/L，酶解温度50 ℃，分别在酶解2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h 时测定黄酮提取量，结果如图4 所示。由图4 可知，酶解时间对酶解效果有一定的影响，开始随着酶解时间的延长，鱼腥草黄酮提取量增大，当提取时间为8 h 时，鱼腥草黄酮提取量最高，达到16.18 mg/g，之后随酶解时间的延长，鱼腥草黄酮提取量出现平稳降低的趋势，因此确定酶解时间以8 h 较为适宜。

图4 酶解时间对鱼腥草黄酮提取的影响

3 结论与讨论

复合酶法提取鱼腥草黄酮研究中，对复合酶比例、复合酶添加量、酶解温度、酶解时间等工艺条件进行了优化，确定了复合酶法提取鱼腥草黄酮的提取工艺为：复合酶比例7∶3，复合酶添加量3 g/L，酶解温度50 ℃，酶解时间8 h，此工艺条件下，鱼腥草黄酮提取量达到16.18 mg/g，工艺条件优化后极大地提高了鱼腥草黄酮的提取量，为之后的工业化酶解提取鱼腥草黄酮提供了技术支持。