除草剂高效氟吡甲禾灵对4种海洋生物的急性毒性效应

刘丽娟 ,何健龙 ,马元庆 ,王玮云 ,姜向阳 ,刘爱英 ,王军,宋秀凯

(1.山东省海洋资源与环境研究院 山东省海洋生态修复重点实验室 烟台 264006;2.中国海洋大学海洋生命学院 青岛 266000)

0 引言

高效氟吡甲禾灵(HPME)的化学名称为2-[4-(3-氯-5-三氟甲基-2-吡啶氧基)苯氧基]丙酸甲酯,分子式为C16H13Cl F3NO4[1],是禾本科植物选择性芳氧苯氧丙酸酯类除草剂,具有杀草快、内吸作用强及对作物高度安全等特点,在农业生产中被广泛用于大豆、棉花、花生、油菜、苗圃、亚麻等阔叶作物田中防除多种禾本科杂草[2-3]。互花米草(Spartinaalterniflora)是世界很多地区海岸带生态系统的入侵者,为防止其快速蔓延,科学家们探索多种物理、化学防治方法[4-8],但至今仍缺少经济、环保、高效的办法解决这一国际性难题[9]。近年来研究发现,HPME 对互花米草的灭除效果良好,不仅能杀死互花米草的地上部分,阻止其种子正常发育,切断其有性繁殖扩散途径,而且能损伤互花米草的根部,有效抑制其无性繁殖。因此,HPME有望在我国互花米草防治工作中发挥重要作用[10-11]。

作为广泛使用的农田除草剂,HPME 在环境中的残留常被检出[12]。HPME 能够影响土壤呼吸强度及土壤酶活性,过量施用及残留对土壤生态系统存在一定的风险[13]。土壤中的HPME 可随降水、淋溶和径流迁移进入水体,如松花江水中检出HPME浓度达9.8μg/L[14],可能对水生态系统安全产生威胁。目前针对HPME 对陆生生物的毒性研究较全面[15-16],现有数据显示其对哺乳动物、鸟类、昆虫的毒性很低。然而HPME对不同水生生物的毒性差异较大,如HPME 能够诱导斑马鱼(Barchydanioreriovar)胚胎发育缺陷[17],对虹鳟(Oncorhynchusmykiss)和蓝鳃太阳鱼(Lepomismacrochirus)的96 h 半数致死浓度(LC50)分别为0.460 mg/L[18]和0.227 mg/L[19],对浮萍(Lemna minor)的14 d半数效应浓度(EC50)为3.1 mg/L,对黑头呆鱼(Pimephalespromelas)的28 d LC50为3.6 mg/L[16]。由于互花米草主要入侵滨海滩涂湿地和河口区域,在喷洒HPME开展互花米草防治的过程中,部分未被吸收的药物进入邻近海域,可能对近岸海水养殖和海洋生态环境产生不良影响。

本研究选取3种我国重要的海洋经济生物即四角蛤蜊(Mactraveneriformis)、刺参(Apostichopus japonicus)和半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis),以及1种互花米草入侵滩涂的生物优势种即琵琶拟沼螺(Assiminea.lutea)为试验对象,采用静水生物试验法分别开展研究,探讨HPME对不同海洋生物的急性毒性效应,确定HPME对不同海洋生物的安全浓度(SC)和毒性等级,以期为评估HPME 在海岸带互花米草防治中的应用前景、保障海水养殖及海洋环境生态安全提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验选用HPME由江苏中旗科技股份有限公司生产,依据相关标准[20]实测浓度为97.9 g/L。试验选用海水取自烟台套子湾近海,经砂滤后使用,盐度为30±1‰,pH 值为8.0±0.1,试验水温为18.0±1.0℃。

1.2 试验生物

四角蛤蜊采自东营近海,壳长2.0～3.1 cm;刺参幼体取自烟台安源水产有限公司,体长8.0～11.8 cm;半滑舌鳎鱼苗取自烟台天源水产有限公司,体长7.3～8.2 cm;琵琶拟沼螺采自烟台莱州互花米草生长区滩涂,壳高3.7～6.5 mm。四角蛤蜊、刺参、半滑舌鳎于室内暂养2周,期间分别投喂单胞藻、刺参配合饲料和鱼用配合饲料,每天投喂2次、换水2次,持续充气,及时挑出死亡和不健康个体,并于试验前1天停止投喂;琵琶拟沼螺于室内充气暂养4 h,不投饵。在4种海洋生物样品中选择体表无损伤、在水中运动活跃、受刺激反应灵敏的健康个体,随机分组用于急性毒性试验。

1.3 试验方法

在15 L的塑料养殖箱中进行试验,试验用水体积为10 L。参考《水生生物毒性试验方法》[21],采用静水生物试验法。在各试验组养殖箱的海水中加入HPME并调至预设浓度,每个箱内放入10只待试生物,期间不投喂、不换水并微量充气;在正式试验开始前分别对每种生物进行预试验,根据预试验结果确定正式试验药品的浓度范围;采用等对数间距法设置7～11个浓度梯度,每个梯度设3个平行,同时做空白对照;在试验过程中随时观察和记录生物的活动状态,及时捞出死亡的个体,并记录24 h、48 h、72 h和96 h的生物死亡数。

关于死亡判定标准,四角蛤蜊为以镊子轻夹双壳后没有闭合反应,刺参为以外力刺激后其体壁及触手不发生收缩反应,半滑舌鳎为伏于水底以及受刺激无反应,琵琶拟沼螺为以眼科镊子拉出厣和腹足刺激后没有明显回缩。

1.4 数据处理

生物死亡率的校正公式[22]为:

式中:P为经校正后的试验组死亡率;C为对照组死亡率;P'为取平行组平均值的试验组死亡率。

采用WPS表格进行试验数据统计,建立质量浓度-死亡率回归方程。采用SPSS 20.0软件中的概率单位回归(Probit)模块,分别进行24 h、48 h、72 h 和96 h 的死亡率卡方检验,计算LC50及其95%置信区间。

根据急性毒性试验数据计算安全浓度,计算公式[21]为:

式中:96 h LC50表示96 h半数致死浓度。

2 结果与分析

2.1 HPME对四角蛤蜊的急性毒性效应

HPME对四角蛤蜊的毒性试验设置1个对照组和9个试验组,HPME 质量浓度分别为0、0.29 mg/L、0.44 mg/L、0.66 mg/L、0.99 mg/L、1.49 mg/L、2.23 mg/L、3.35 mg/L、5.02 mg/L 和7.53 mg/L。在试验过程中,对照组中所有四角蛤蜊的水管和斧足很快从壳中伸出,形态舒展,受外界刺激后立即缩回壳内且双壳紧闭。各试验组中四角蛤蜊的反应能力均有所下降,其中HPME 浓度0.29 mg/L组和0.44 mg/L 组中四角蛤蜊水管伸出壳的长度稍短,受刺激后缩回且双壳紧闭;0.66 mg/L及以上组中多数四角蛤蜊闭壳肌松弛,贝壳呈微张状态,对刺激反应迟缓,斧足回缩和闭壳反应缓慢。在HPME胁迫24 h后,0.99 mg/L及以上组中的四角蛤蜊出现死亡个体,且死亡率随HPME浓度升高而逐步上升,其中7.53 mg/L 组中的死亡率最高,达93.3%。随着胁迫时间的延长,各试验组中的四角蛤蜊死亡率均逐步上升。至HPME 胁迫96 h时,对照组和0.29 mg/L 组中的四角蛤蜊无死亡,而2.23 mg/L及以上组中的四角蛤蜊全部死亡(图1)。

图1 不同试验时间的四角蛤蜊死亡率与HPME质量浓度的关系Fig.1 Relationship between mortality rate of Mactra veneriformis and HPME mass concentration in different experiment time

2.2 HPME对刺参幼体的急性毒性效应

HPME对刺参幼体的毒性试验设置1个对照组和11个试验组,HPME 质量浓度分别为0、1.17 mg/L、1.29 mg/L、1.42 mg/L、1.56 mg/L、1.72 mg/L、1.89 mg/L、2.08 mg/L、2.20 mg/L、3.30 mg/L、4.96 mg/L和7.43 mg/L。在试验过程中,对照组中所有刺参的背部疣刺自然突出,以管足牢固附着于水箱壁或充气石上,受外界刺激后参体立即收缩,反应灵敏。试验组中刺参的体壁松弛,体型延长,运动能力下降,具体表现为管足吸附力减弱、贴壁率显著降低以及受刺激后反应迟缓。在HPME 胁迫24 h后,1.17 mg/L 组中的刺参贴壁率为10%,显著低于对照组的贴壁率100%,其他试验组中的刺参无贴壁现象;1.56 mg/L 及以上组中的刺参整体呈麻痹状态横卧于水中,个别刺参出现排脏现象,疣刺开始泛白和肿胀,甚至表皮破裂和溃烂;3.30 mg/L及以上组中的刺参出现死亡个体,且死亡率随HPME浓度升高而上升,7.43 mg/L组中的刺参全部死亡。在HPME 胁迫48 h后,各试验组中的刺参死亡率急剧上升,其中1.56 mg/L 组中的刺参出现死亡个体,2.20 mg/L 组中的刺参全部死亡。至HPME 胁迫96 h时,1.17 mg/L 组中的刺参出现死亡个体,1.89 mg/L组中的刺参全部死亡。由此可见,刺参在24 h内对HPME的耐受性较高,但其耐受性随胁迫时间的延长而快速下降(图2)。

图2 不同试验时间的刺参幼体死亡率与HPME质量浓度的关系Fig.2 Relationship between mortality rate of Apostichopus japonicas larvae and HPME mass concen-tration in different experiment time

2.3 HPME对半滑舌鳎鱼苗的急性毒性效应

HPME对半滑舌鳎鱼苗的毒性试验设置1个对照组和7 个试验组,HPME 质量浓度分别为0、0.29 mg/L、0.35 mg/L、0.42 mg/L、0.51 mg/L、0.61 mg/L、0.73 mg/L和0.88 mg/L。在试验过程中,对照组中所有半滑舌鳎游动活跃,而各试验组中半滑舌鳎运动能力下降,其中0.73 mg/L 及以上组中的半滑舌鳎出现鱼体腹面朝上现象。在HPME胁迫24 h时,0.73 mg/L组中的半滑舌鳎出现死亡个体,0.88 mg/L组中的半滑舌鳎全部死亡。在HPME胁迫72 h时,0.61 mg/L 组中的半滑舌鳎出现死亡个体。在 HPME 胁迫96 h 时,0.73 mg/L组中的半滑舌鳎全部死亡。由此可见,在达到某个临界值后,半滑舌鳎鱼苗的死亡率随HPME浓度升高而快速上升(图3)。

图3 不同试验时间的半滑舌鳎鱼苗死亡率与HPME质量浓度的关系Fig.3 Relationship between mortality rate of Cynoglossus semilaevis fry and HPME mass concentration in different experiment time

2.4 HPME对琵琶拟沼螺的急性毒性效应

HPME对琵琶拟沼螺的毒性试验设置1个对照组和7个试验组,HPME质量浓度分别为0、1.47 mg/L、2.20 mg/L、3.30 mg/L、4.96 mg/L、7.43 mg/L、11.15 mg/L和16.73 mg/L。由于琵琶拟沼螺体型小,判断其死亡的方法对其个体伤害很大,仅统计其在HPME 胁迫96 h 时的死亡率。在试验过程中,对照组中所有琵琶拟沼螺很快伸出腹足吸附于养殖箱壁并向上攀爬,受刺激后立即从箱壁脱落,腹足迅速收回壳内且厣紧闭。试验组中琵琶拟沼螺运动能力下降,无以腹足贴箱壁攀爬现象,多数螺的厣闭口不紧,腹足松弛且稍伸出壳外,受刺激后反应迟缓,个别螺厣紧闭。随着HPME胁迫时间的延长,试验组中所有琵琶拟沼螺均分泌黏液将厣及螺口包围,且黏液量随HPME 浓度升高而增加。在HPME胁迫96 h时,2.20 mg/L 组中的琵琶拟沼螺出现死亡个体,16.73 mg/L组中的琵琶拟沼螺死亡率为86.7%(图4)。

图4 96 h的琵琶拟沼螺死亡率与HPME质量浓度的关系Fig.4 Relationship between mortality rate of Assiminea.lutea and HPME mass concentration in 96 h

2.5 HPME对4种海洋生物的急性毒性特征

试验结果显示,在不同HPME 胁迫时间下,4种海洋生物的死亡率与HPME 质量浓度的对数均呈显著的正相关关系(p<0.05)。其中,四角蛤蜊、刺参幼体和半滑舌鳎鱼苗的LC50随HPME 胁迫时间的延长而减小,具有明显的累积毒性(表1)。

表1 HPME对4种海洋生物的急性毒性特征Table 1 The acute toxicity characteristics of Haloxyfop-R-methyl to 4 marine organisms

依据试验所得安全浓度,HPME 急性毒性由大至小的海洋生物依次为半滑舌鳎鱼苗、四角蛤蜊、刺参幼体、琵琶拟沼螺,其中鱼类对HPME最敏感。以96 h LC50为依据进行毒性等级划分[23],HPME对半滑舌鳎鱼苗和四角蛤蜊的毒性为高毒(0.1 mg/L<96 h LC50≤1.0 mg/L),对刺参幼体和琵琶拟沼螺的毒性为中毒(1.0 mg/L<96 h LC50≤10.0 mg/L)。

3 讨论

3.1 HPME的生物毒性效应

HPME 暴露能改变大鼠(Rattusnorvegicus)的肝肾功能,并诱导其氧化应激和睾丸的形态学变化[24];HPME 具有神经毒性,会造成小鼠(Mus musculus)的捕食行为障碍[25];HPME 可抑制塔氏油白鱼(Chalcalburnustarichii)的谷胱甘肽转移酶活性,人类长期摄入可能致使肝脏肿瘤产生[26];HPME可通过氧化应激反应等造成斑马鱼胚胎发育缺陷,降低其孵化率,还会使斑马鱼脊柱变形,抑制其运动能力,降低其心率和存活率[17]。本研究试验发现,四角蛤蜊、刺参幼体、半滑舌鳎鱼苗和琵琶拟沼螺受HPME胁迫后均表现出肌肉松弛、运动能力下降和受外界刺激反应迟钝现象,表明HPME对4种海洋生物均具有神经毒性,与对小鼠的研究结果[25]相符。HPME对4种海洋生物的LC50均随胁迫时间的延长而减小,表明存在较为明显的蓄积急性致毒效果。在互花米草防治过程中,HPME 能在短期改变互花米草根际土壤中的微生物丰度和群落结构,并导致细菌多样性的变化[27]。

3.2 HPME对水生生物的急性毒性

HPME 对淡水鱼虹鳟和蓝鳃太阳鱼的96 h LC50分别为0.460 mg/L[18]和0.227 mg/L[19],与海水鱼许氏平鲉(Sebastesschlegelii)的0.578 mg/L[28]和半滑舌鳎鱼苗的0.656 mg/L 差距不大。HPME对淡水节肢动物大型溞(Daphnia magna)的48 h EC50不小于12.300 mg/L[18],而对海水节肢动物安氏伪镖水蚤(Pseudodiaptomusannandalei)的48 h LC50为0.107 mg/L[28]。HPME对海水双壳贝类牡蛎(Crassostreagigas)的96 h LC50(47.100 mg/L)[28]为四角蛤蜊(0.888 mg/L)的53倍,分析认为这是由于牡蛎的闭壳肌发达且抗逆性强,受外界刺激后立即紧闭双壳将其软体部分与海水隔绝,从而能够显著降低HPME 的伤害。本研究中,HPME 对琵琶拟沼螺的96 h LC50(8.674 mg/L)为半滑舌鳎鱼苗(0.656 mg/L)的13倍,在试验过程中发现当琵琶拟沼螺受外界刺激后,所有螺口均分泌黏液将螺口及厣紧密包围,且黏液量随HPME浓度升高而增加,推测得益于厣和黏液的保护作用,使螺的软体部分与海水中的污染物隔离,从而提高其对HPME的耐受性。结果显示,HPME对不同海洋生物的急性毒性差异很大,其中对安氏伪镖水蚤、许氏平鲉、半滑舌鳎鱼苗和四角蛤蜊为高毒,对刺参和琵琶拟沼螺为中毒,对牡蛎为低毒。

结合其他研究结果[29-30],不同除草剂对同种海洋生物的急性毒性差异也很大。按有效成分计,6种除草剂对刺参幼体的毒性由大到小依次为百草枯(0.032 1 mg/L)、HPME (1.382 0 mg/L)、灭草松(3.115 6 mg/L)、乙草胺(3.445 5 mg/L)、扑草净(7.440 0 mg/L)、特丁基三嗪(14.886 0 mg/L);对刺参幼体的毒性等级,百草枯为剧毒(96 h LC50≤0.1 mg/L),特丁基三嗪为低毒(96 h LC50>10.0 mg/L),其他4种除草剂均为中毒(1.0 mg/L<96 h LC50≤10.0 mg/L)[23]。

3.3 HPME在海岸带生态修复中应用的可行性

HPME在世界范围内被广泛应用于农田清除禾本科杂草[9,31],具有毒性低、分解代谢快的特点。近年来研究发现,当HPME 用量为0.432 kg/hm2时,可对互花米草达到良好的防治效果[4,9],且HPME为苗后除草剂,施药后其大部分吸附于互花米草叶片上并被迅速吸收,少量落在土壤中的药物残留量呈指数衰减,半衰期为2.6～4.9 d,在30 d后几乎全部消失[13]。本研究项目组于2020年9月在莱州沙河滩涂开展互花米草防治实验的结果显示,HPME喷施0.194 kg/hm2能够有效杀灭互花米草,对混生的本土植物盐地碱蓬(Suaedasalsa)和盐角草(Salicorniaeuropaea)无影响,且实验区滩涂的生物种类和结构未见明显变化,优势种琵琶拟沼螺、古氏滩栖螺(Batillariacumingi)和红树拟蟹守螺(Cerithidearhizophorarum)均未发生死亡现象。可见,使用HPME防治互花米草具有用量少、见效快和效果好的优势。在黄河三角洲的实验发现,在施药11 个月后,HPME 实验区的日本刺沙蚕(Neanthesjaponica)数量远高于对照组[10],与在澳大利亚盐沼开展的精吡氟禾草灵防控大米草(Spartinaanglica)的长期生态影响的研究结果一致[32]。由于我国海岸带生物资源丰富,海水养殖业发达,近岸海域及滨海滩涂遍布养殖区,海岸周边分布大量海水养殖场和育苗场,在使用HPME开展互花米草防治时,必须开展HPME对海洋生物生态的安全性评估。

本研究试验选取的四角蛤蜊、刺参、半滑舌鳎和琵琶拟沼螺分别为海洋双壳贝类、棘皮类、鱼类和腹足类动物,对于开展HPME在海岸带生态修复中的应用风险评估具有一定的参考价值。然而一方面,海洋生物种类繁多且生活史复杂,有必要进一步开展HPME对海洋生物生长繁殖和胚胎发育的影响和毒性机理,以及HPME在不同海洋生物体内富集代谢的规律等研究,以全面评价HPME的安全性;另一方面,应用HPME 防治互花米草具有用量低、效果好、成本低、可机械化操作的优势,应积极研究和筛选适用区域,优化施药量、施药方法和施药时间,并及时开展跟踪监测和评价,确保海水养殖及海洋生态环境安全。

4 结语

在除草剂HPME 的胁迫下,四角蛤蜊、刺参幼体、琵琶拟沼螺和半滑舌鳎鱼苗均表现出肌肉松弛、运动能力下降和受外界刺激反应迟钝现象,表明HPME对海洋生物具有神经毒性;随着HPME胁迫时间的延长,4种海洋生物的LC50均逐渐下降,表明HPME具有蓄积急性致毒效应。按HPME急性毒性由大到小排列,4种海洋生物依次为半滑舌鳎鱼苗、四角蛤蜊、刺参幼体、琵琶拟沼螺,总体表现为HPME对鱼类和双壳贝类为高毒,对棘皮类和腹足类为中毒。因此,使用HPME开展互花米草防治应做好用药前的生态风险评估,并严格控制HPME剂量。