血根碱基于PI3K/AKT 通路抑制结肠癌细胞增殖和迁移的机制研究

王 密 翁春燕

结肠癌是全球最普遍的消化道恶性肿瘤之一，发病率和死亡率逐年上升[1]。手术治疗仍然是目前原发性结肠癌主要外科治疗方法，易辅以放化疗等，但其“发现晚、多耐药、易复发”的典型特点易导致治疗失败，从而难以获得较好的预后效果。尽管新型靶向药物针对多种癌症（包括结肠癌）的研究也获得了进展，但其应用仍存在较大的局限性；而经典的化疗手段由于其自身难以解决的耐药性高及生物敏感性过低等问题，治疗效果不甚理想。血根碱作为一种分布广、易养殖的苯并菲啶类生物碱中药提取物，其多种抗癌机制受到越来越多的重视[2]。因此，本研究选用人类结肠癌细胞（HCT-8 细胞和SW-620 细胞），重点研究血根碱对人体结肠癌的影响，并进一步探究其作用于体内外肿瘤的可能药物作用机制。

1 实验材料

1.1 细胞株 人正常结直肠黏膜细胞系FHC（批号CRL-1831）和结肠癌细胞系HCT-8（批号CCL-244）、SW-620（批号CCL-227）购自American Type Culture Collection（ATCC）。

1.2 动 物 4～5 周龄SPF 级别的BALB/c 裸鼠6只，购于上海BK 公司，雌性，体质量（16～20）g，饲养于浙江中医药大学动物实验中心无特定病原屏障中心，饲养湿度为（50±5）%，温度（25±2）℃，各12 h 的光、暗循环。所有动物实验均在动物伦理委员会审核通过后进行（伦理审批号：IACUC-20221008-04）。动物生产许可证号：SCXK（沪）2022-0004；动物质量合格证号：SCXK（沪）2022-0004；动物使用许可证号：SCXK（浙）2021-0012。

1.3 试 剂 血根碱（货号HY-N005） 购自MedChemExpress，使用DMSO 配制成2 mmol/L 的浓度进行保存；血根碱溶液采用DMSO 及生理盐水溶解至100 mg/mL 待用；使用前，使用相应培养基配制成所需的工作浓度。胎牛血清（FBS，货号16140-071）、1640 培养液（货号72400047）、杜尔伯科改良伊格尔（DMEM，货号C11995500BT）培养基均购自美国Gibco 公司；RIPA 裂解液（货号PC101）、蛋白酶抑制剂混合液（货号PC101）、磷酸酶抑制剂混合液（货号FGR102）等细胞裂解液相关试剂均购自雅酶生物科技有限公司；磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K，货号4255）、丝氨酸/苏氨酸激酶（AKT，货号4691）、磷酸化丝氨酸/苏氨酸激酶（p-AKT，货号4060）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR，货号2983）、E-钙黏蛋白（E-cad，货号14472）、N-钙黏蛋白（N-cad，货号13116）、β-肌动蛋白（β-Actin，货号3700）等抗体均购自CST；细胞计数试剂盒（CCK-8，货号GK10001） 购自GLPBIO；多聚甲醛购自默克（货号30525-89-4）。

1.4 主要仪器 超净工作台（上海博迅实业有限公司医疗设备厂，型号：HF safe 1500LC）；蛋白质印迹法检测系统（美国Bio-Rad 公司，型号：Universal Hood Ⅲ）；SDS-PAGE 电泳仪装置（美国Bio-Rad 公司，型号：1658004）等。

2 实验方法

2.1 形态学观察 将人结肠癌HCT-8 细胞接种在6 孔板中，当细胞生长面积达一半以上时，弃上清液，加入2 mL 预定含量血根碱的培养基（0、2、4、8 μmol/L）处理24 h，显微镜下观察细胞状态。

2.2 CCK-8 实验 将稳定生长的人结肠癌细胞（HCT-8 和SW-620）以5000 个细胞数量均匀混合并接种于96 孔板中培养至贴壁（6～8 h）。随后换液，加入预定含量血根碱的培养基（0、3、6、9、18 μmol/L）干预培养24 h 换液，加入适量CCK-8 溶液，选取恰当的时间（1～4 h 内）置于酶标仪中检测，确保对照组在450 mm 激发光的吸光数值在0.8～1.2。

2.3 细胞划痕实验 将稳定生长的人结肠癌细胞HCT-8 以50 万个细胞接种于6 孔板中。当细胞汇合度达90%的时候，使用枪头制造“细胞伤痕”。加入不同浓度血根碱的培养液（0、2、4、8 μmol/L）进行干预培养，倒置显微镜直视下观察细胞的汇合程度，并进行拍照记录（0、12、24、48 h）。

2.4 细胞克隆形成实验 将稳定生长的人结肠癌细胞（HCT-8 和SW-620）混合均匀，以1000 个细胞数量接种至6 孔板中，加入不同浓度血根碱的培养液（0、2、4、8 μmol/L）培养干预，置于温度37 ℃，含5%CO2的培养箱中培养10～14 d，期间定期3～4 d 换各自相应含量的血根碱培养液。当培养皿中出现肉眼可见的克隆形成时，先后加入多聚甲醛、结晶紫染色，洗净晾干，观察和记录细胞的克隆个数。

2.5 蛋白质印迹法 将稳定生长的人结肠癌细胞HCT-8 接种于6 cm 皿中，待细胞贴壁后使用含不同浓度血根碱的培养液（0、2、4、8 μmol/L）进行培养。收集细胞加入裂解液充分溶解并置于4 ℃离心机中（转速10000 r/min）离心15 min。随后制备成含上样缓冲液的蛋白样品。采用SDS-PAGE 分离蛋白，电转移至PVDF 膜上，予5%脱脂牛奶封闭1 h，置于一抗中并于4 ℃摇床上孵育过夜，予TBST 漂洗3 遍，每遍10 min，随后加入二抗，室温孵育1 h，再予TBST漂洗3 遍，每遍10 min，洗膜后经ECL 试剂显色、曝光。结果采用Image J 软件对目的条带进行灰度值测定。

2.6 体内动物实验 将处于对数生长期的HCT-8细胞以100 万/200 μL 注射至小鼠左侧腋下皮下；待肿瘤体积生长至100 mm3左右时，按照随机数字表法将裸鼠分成对照组和血根碱组，每组3 只。血根碱组予10 mg/kg 血根碱溶液腹腔注射治疗，每天1 次；对照组予等量生理盐水腹腔注射安慰治疗。每周测量1 次皮下肿瘤长径、短径及小鼠体质量。待治疗28 d 后，安乐死小鼠并称量小鼠肿瘤质量。小鼠肿瘤体积计算方法：长径×短径2×1/2。

2.7 统计学方法 应用GraphPad Prism 9 及SPSS 22.0 进行绘图及统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，两组比较采用独立样本t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 血根碱对结肠癌细胞形态的影响 为初步判定血根碱对结肠癌细胞是否存在毒性作用，予不同浓度的血根碱处理HCT-8 细胞24 h。如图1 所示，对照组细胞状态良好，细胞紧密贴壁，形态饱满（HCT-8 细胞呈菱形），细胞膜光滑完整；而在不同浓度的血根碱处理组中，细胞贴壁能力下降，分泌物增多，形态皱缩至圆形，并出现不同程度的胞膜破裂。

图1 不同浓度血根碱处理后人结肠癌细胞HCT-8 的细胞形态（×40）

3.2 血根碱对结肠癌细胞活性的影响 与对照组比较，血根碱以浓度依赖性（3、6、9、18 μmol/L）对结肠癌细胞HCT-8 和SW-620 具有较强的杀伤作用（P 均＜0.05）；并且血根碱对正常人结肠黏膜细胞FHC 的杀伤作用明显弱于对结肠癌细胞的杀伤作用。进一步计算出血根碱对HCT-8、SW620 和FHC 的半数抑制浓度（median inhibition concentration，IC50） 分别为（3.40±0.03）、（5.32±0.12）和（14.98±1.34）μmol/L。见表1～2。

表1 血根碱对HCT-8、SW-620 和FHC 细胞活力的影响（%，±s）

表1 血根碱对HCT-8、SW-620 和FHC 细胞活力的影响（%，±s）

注：HCT-8 和SW-620 为人结肠癌细胞；FHC 为人正常肠上皮细胞；与同浓度血根碱处理下的FHC 组比较，aP＜0.05

细胞HCT-8 SW-620 FHC血根碱浓度孔数333 0 μmol/L 100.00±2.47 100.00±2.38 100.00±3.53 3 μmol/L 66.11±1.11a 76.88±3.27a 93.67±2.42 6 μmol/L 40.49±2.36a 54.90±2.24a 77.53±2.01 9 μmol/L 16.11±1.52a 30.83±1.70a 66.21±2.62 18 μmol/L 1.13±0.23a 3.11±0.18a 30.82±1.83

表2 血根碱对HCT-8、SW-620 和FHC 细胞的IC5（0μmol/L，±s）

表2 血根碱对HCT-8、SW-620 和FHC 细胞的IC5（0μmol/L，±s）

注：IC50 为半数抑制浓度；HCT-8 和SW-620 为人结肠癌细胞；FHC 为人正常肠上皮细胞；与FHC 比较，aP＜0.05

细胞HCT-8 SW-620 FHC孔数333血根碱的IC50 3.40±0.03a 5.32±0.12a 14.98±1.34

3.3 血根碱对结肠癌细胞增殖的影响 与对照组比较，血根碱以浓度依赖形式明显抑制了HCT-8 和SW-620 细胞的克隆形成大小和个数（0、2、4、8 μmol/L血根碱处理下的SW-620 和HCT-8 的克隆数分别是81、40、22、11 个和63、26、22、7 个）。见图2。

图2 不同浓度血根碱对结肠癌细胞增殖的影响

3.4 血根碱对结肠癌细胞迁移的影响 使用不同浓度血根碱处理结肠癌HCT-8 细胞0、12、24、48、72 h，结果如图3 和表3 所示，随着血根碱浓度的提高，细胞划痕的愈合能力逐渐下降（P<0.05）。

表3 血根碱对HCT-8 的迁移抑制率（%，±s）

表3 血根碱对HCT-8 的迁移抑制率（%，±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05

血根碱浓度0 μmol/L 2 μmol/L 4 μmol/L 8 μmol/L实验次数3333细胞迁移率59.43±5.05 24.55±5.45a 15.50±3.38a 3.36±2.37a

图3 血根碱治疗HCT-8 细胞划痕实验的代表性图片（×16）

3.5 血根碱对结肠癌细胞中E-cad、N-cad、PI3K、AKT 蛋白水平的影响 如图4 和表4 所示，血根碱以浓度依赖性提高了HCT-8 细胞E-cad 的表达，降低了N-cad 的表达（P<0.05）。此外，血根碱明显下调PI3K、p-AKT、mTOR 的蛋白表达水平（P<0.05）。

表4 血根碱治疗HCT-8 细胞后相关蛋白的相对表达水平（±s）

表4 血根碱治疗HCT-8 细胞后相关蛋白的相对表达水平（±s）

注：PI3K 为磷脂酰肌醇3-激酶；AKT 为丝氨酸/苏氨酸激酶；p-AKT 为磷酸化AKT；mTOR 为雷帕霉素靶蛋白；E-cad 为E-钙黏蛋白；N-cad 为N-钙黏蛋白；与0 μmol/L 血根碱组比较，aP＜0.05

血根碱浓度0 μmol/L 2 μmol/L 4 μmol/L 8 μmol/L实验次数3333 E-cad 0.44±0.11 0.60±0.02a 0.86±0.07a 1.00±0.03a N-cad 1.00±0.08 0.80±0.12a 0.51±0.08a 0.29±0.03a PI3K 1.00±0.05 0.88±0.04a 0.81±0.03a 0.67±0.06a AKT 1.00±0.14 1.11±0.09 1.00±0.07 0.97±0.01 p-AKT 1.00±0.08 0.77±0.06a 0.70±0.03a 0.47±0.03a mTOR 1.00±0.09 0.79±0.13a 0.55±0.11a 0.34±0.03a

图4 血根碱治疗HCT-8 细胞后相关蛋白的代表性图片

3.6 血根碱在体内对结肠癌的影响 为明确血根碱在体内对结肠癌的抑制作用，我们构建了HCT-8 皮下荷瘤小鼠模型。相较于对照组，血根碱治疗组小鼠肿瘤体积（见图5）及肿瘤质量（见表5）明显下降（P<0.05）。此外，治疗过程中两组小鼠体质量未出现明显差异，提示血根碱能够在不对宿主造成药物毒性的状态下抑制结肠癌肿瘤生长。

表5 HCT-8 细胞荷瘤小鼠在血根碱治疗期间皮下肿瘤体积大小及肿瘤质量（±s）

表5 HCT-8 细胞荷瘤小鼠在血根碱治疗期间皮下肿瘤体积大小及肿瘤质量（±s）

注：与对照组同期比较，aP＜0.05

组别对照组血根碱组鼠数33第0 天105.78±6.63 108.14±4.88肿瘤体积（mm3） 肿瘤质量（g）1.01±0.21 0.63±0.11a第28 天862.28±133.90 367.48±30.17a

图5 HCT-8 细胞荷瘤小鼠在血根碱治疗后皮下肿瘤图片

4 讨 论

既往研究表明，血根碱可以在头颈癌、肺癌、胃癌等多种癌症中诱导凋亡从而抑制癌症的发生发展[3]。PI3K/AKT 信号通路在许多肿瘤中出现异常活动，并参与调控细胞增殖、转化、细胞外基质降解等功能，激活肝癌、口癌、消化道肿瘤的全程[4]。mTOR 拾取并整合由营养摄入、生长因子和其他细胞刺激引发的信号，以调节下游信号传导和蛋白质合成。通过其下游效应器4EBP1 和P70S6 激酶（S6K），参与将mRNA核糖体翻译成细胞生长、细胞周期进程和细胞代谢所必需的蛋白质[5]。此外，血根碱可通过PI3K/AKT 信号通路失活诱导人口腔鳞状细胞癌KB 细胞凋亡[6]。因此，本研究旨在探索血根碱是否可以通过调控PI3K/AKT 通路抑制结肠癌细胞。

本研究检测了不同浓度的血根碱对结肠癌细胞的增殖、迁移等的影响。结果表明，血根碱能够呈浓度依赖性地抑制结肠癌HCT-8 和/或SW-620 细胞的增殖、迁移等能力；并在体内实验发现，血根碱能够有效抑制结肠癌肿瘤生长；随着血根碱浓度的增高，PI3K、AKT、mTOR 的蛋白表达量受到明显抑制，说明血根碱可抑制PI3K 磷酸化，减少AKT 活化抑制下游蛋白信号转导，负向调节PI3K/AKT 信号通路抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

总之，本研究结果表明，血根碱对结肠癌细胞的生长表现出有效的抑制作用，可能通过下调PI3K/AKT/mTOR 通路影响结肠癌细胞的生物活性。