Elafibranor对前列腺癌细胞增殖、迁移和凋亡行为的影响及机制研究

艾俊杰,王子健,倪 维,林晓娟

(1.湖北省中医院检验科,湖北武汉 430061;2.武汉大学中南医院泌尿外科,湖北武汉 430071)

前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率占全部恶性肿瘤的第5位[1]。前列腺癌易发生骨转移,并导致严重的骨骼反应(如骨痛、骨折、神经压迫等),损害患者的生活质量。值得注意的是,原位前列腺癌患者的5年生存率高达100%,而转移性前列腺癌的5年生存率仅有29.8%[2]。现有的化疗药物,如卡唑和醋酸阿比特龙,只能将患者的生存期延长2.4～4.8个月[3]。因此,有必要开发新型的抗肿瘤药物。近年来,肿瘤饥饿疗法作为一种新颖的干预策略得到了广泛的关注[4-5]。Elafibranor (ELA)是过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR-a/δ)的双重抑制剂,由HANF等[6]于2010年首次报道。ELA已被广泛用于治疗肥胖相关性疾病,如非酒精性脂肪性肝炎、血脂异常和2型糖尿病。CARIOU等[7]报道ELA在抑制脂肪酸氧化供能方面具有显著的作用。不难推测,ELA有望阻断前列腺癌脂代谢通路取得良好的抗肿瘤效果。目前,ELA对人前列腺癌的治疗效果及机制仍有待于实验研究。本课题采用不同剂量的ELA处理前列腺癌DU145细胞,初步探讨了ELA对DU145细胞增殖、迁移和凋亡行为的影响及机制,将为临床转化研究提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料前列腺癌DU145细胞购于中科院上海细胞库。ELA购于上海陶术生物有限公司。细胞凋亡染色试剂盒购于天津三箭生物技术有限公司。组织细胞RNA小提取试剂盒购于北京天根生化科技有限公司。荧光定量PCR试剂盒购于上海伯乐生命医学产品有限公司。DMEM培养基、胎牛血清、胰酶、MTT试剂购于美国Gibco生物有限公司。PCR引物由武汉擎科生物有限公司合成。

1.2 细胞培养将DU145细胞重悬于含10%胎牛血清的DMEM完全培养基中,并置于37 ℃,含5%CO2的恒温培养箱内静置过夜,使细胞贴壁生长。待细胞长满后,采用0.25%胰酶溶液消化细胞,收集细胞用于后续实验。

1.3 细胞增殖实验配制不同浓度ELA药液,用于重悬DU145细胞,调整细胞密度至1.5×104个/mL。将细胞接种于96孔组织培养板中,每孔添加量为200 μL。培养48 h后,向每孔中加入20 μL MTT试剂,继续培养4 h。采用二甲基亚砜溶解培养板底部的结晶。混合溶液的吸光度值采用多功能酶标仪进行测定,检测波长为490 nm。

1.4 细胞迁移实验

1.4.1划痕实验 将细胞接种于6孔组织培养板中,培养至细胞汇合度超过80%后采用200 μL枪头在培养板底部画一条宽度均匀的划痕。采用磷酸盐缓冲液清洗培养板3次,然后加入含有ELA的完全培养基,继续培养24 h。采用倒置荧光显微镜(Leica,German)拍摄划痕的照片,划痕的宽度采用Image J软件进行分析。

1.4.2Transwell实验 收集细胞沉淀,采用无血清培养基重悬细胞,并调整细胞密度至3×105个/mL。取200 μL细胞悬液加入到Transwell小室上层,取700 μL含有ELA的完全培养基加入到Transwell小室下层。常规培养24 h使细胞由上层迁移至下层。采用4%(体积分数)多聚甲醛溶液固定细胞,用棉签拭去上室未迁移的细胞,下室细胞采用0.1%(体积分数)结晶紫溶液染色。采用倒置荧光显微镜(Leica,German)拍摄细胞的照片,统计迁移细胞的相对数量。

1.5 细胞凋亡实验采用含有ELA的完全培养基重悬细胞,将细胞接种于6孔组织培养板内,常规培养48 h。消化细胞,将细胞收集于1.5 mL 离心管内。采用细胞凋亡染色试剂盒处理细胞,实验方法参照试剂盒说明书进行。细胞凋亡率采用流式细胞仪(Beckman,USA)进行检测,统计早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的占比。

1.6 基因表达检测将细胞与ELA共培养48 h,收集细胞,采用组织细胞总RNA小提取试剂盒分离细胞的RNA,然后采用微量分光光度计(Nanodrop,USA)检测RNA的浓度和纯度。采用一步法逆转录试剂盒制备cDNA,然后采用荧光定量多聚酶链反应(qRT-PCR)检测目的基因的表达情况。本研究采用的引物序列见表1。

表1 引物序列表

2 结 果

2.1 ELA抑制前列腺癌DU145细胞增殖将DU145细胞与ELA共培养48 h,然后采用 MTT 法检测受试细胞的增殖活性。如图1所示,随着ELA给药浓度由0 μmol/L增加至30 μmol/L,受试细胞的相对细胞增殖率呈现出明显的降低趋势。将0 μmol/L组的相对细胞增殖率设定为100%,则5、10、15、20、25、30 μmol/L组的相对细胞增殖率分别为(86.9±7.8)%、(75.9±10.1)%、(58.5±9.4)%、(48.7±6.9)%、(37.6±4.9)%、(26.1±2.8)%。综上所述,ELA的作用效果具有明显的剂量依赖性。为简化实验分组,我们拟选取ELA的浓度为0 μmol/L作为空白组、5 μmol/L作为低剂量组、15 μmol/L作为高剂量组开展后续实验。

2.2 ELA抑制前列腺癌DU145细胞迁移本研究采用两种实验方法评估ELA对DU145细胞迁移能力的影响。图2A、B是划痕实验的结果:空白组(0 μmol/L)、低剂量组(5 μmol/L)和高剂量组(15 μmol/L)的划痕愈合率分别为(74.7±3.2)%,(61.8±2.9)%,(53.2±3.3)%,三组相比,差异均具有统计学意义(P<0.001)。图2C、D是Transwell实验的结果:将空白组(0 μmol/L)的相对迁移细胞数设置为100%,低剂量组(5 μmol/L)和高剂量组(15 μmol/L)的相对迁移细胞数分别为(32.4±11.2)%,(15.4±3.2)%,三组相比,差异均具有统计学意义(P<0.001)。综上所述,ELA可以显著抑制前列腺癌DU145细胞迁移。

A、B:不同剂量(0、5、15 μmol/L)的ELA对前列腺癌DU145细胞划痕迁移能力的抑制效果;C、D:不同剂量(0、5、15 μmol/L)的ELA对DU145细胞Transwell迁移能力的抑制效果。与空白组(0 μmol/L)相比,**P<0.01,***P<0.001。

2.3 ELA促进前列腺癌DU145细胞凋亡细胞凋亡不足是肿瘤细胞区别于正常组织细胞的重要特征。诱导细胞凋亡是抗肿瘤药物的经典作用途径之一。本研究评估了ELA对前列腺癌DU145细胞凋亡行为的影响。如图3A、B所示,空白组(0 μmol/L)、低剂量组(5 μmol/L)和高剂量组(15 μmol/L)的细胞凋亡率分别为(9.3±1.4)%、(11.3±0.3)%和(15.2±4.5)%。高剂量组(15 μmol/L)与空白组(0 μmol/L)的细胞凋亡率相比差异具有统计学意义(P<0.05)。因此,ELA可以显著促进前列腺癌DU145细胞凋亡,进一步证实了其作为抗肿瘤药物的应用潜力。

A、B:不同剂量(0、5、15 μmol/L)的ELA对前列腺癌DU145细胞凋亡率的影响。与空白组(0 μmol/L)相比,*P<0.05。

2.4 ELA干扰前列腺癌DU145细胞的能量代谢ELA是过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR-a/δ)的双重抑制剂。PPAR-a/δ的主要功能是参与细胞糖代谢和脂代谢调节过程,为细胞生物学行为提供能量[8]。为探究ELA的作用机制,本研究还检测了PPAR-a/δ通路中一系列关键基因的表达变化。如图4A～F所示,经ELA处理48 h后,高浓度组中固醇载体蛋白X(sterol carrier protein X,SCPX)、磷脂转移蛋白(phospholipid transfer protein,PLTP)、丙酮酸脱氢酶激酶1(pyruvate dehydrogenase kinase-1,PDK1)、整合素连接激酶(intergin linked kinase,ILK)、脂酰辅酶A氧化酶2(acyl-CoA oxidase 2,ACOX2)基因的表达量较空白组显著降低,脂肪分化相关蛋白(perilipin-2,PLIN2)基因的表达量较空白组显著提高,差异均具有统计学意义(P<0.01)。ELA可以有效地抑制脂肪酸的摄取(SCPX、PLTP),启动脂肪酸储存(PLIN2)、抑制脂肪酸氧化分解(PDK1、ACOX2),通过多种途径减少脂肪酸氧化供能,并对细胞内抗肿瘤信号转导也有一定的调控作用(ILK)。

A:SCPX;B:PLTP;C:PLIN2;D:PDK1;E:ILK;F:ACOX2。与空白组(0 μmol/L)相比,**P<0.01,***P<0.001。

3 讨 论

前列腺癌是一种好发于中老年男性的恶性肿瘤,其中约54%的患者在初诊时已出现远处转移[9]。前列腺癌的首选治疗方式为去势治疗,可以迅速降低体内雄激素含量,延缓肿瘤临床和影像进展[10]。药物化疗,如多西他赛、阿比特龙、阿帕鲁胺、恩杂鲁胺等作为重要的辅助治疗方式之一,得到了欧洲泌尿外科学会(European Association of Urology,EAU)临床指南的强烈推荐[11]。近年来,转移性前列腺癌的耐药性呈现出快速增长的趋势,给临床治疗带来了一定的挑战。而研发新型化疗药物是克服肿瘤耐药性的有效途径之一。

前列腺癌的能量供应一部分来源于有氧糖酵解,而另一部分来源于脂肪酸氧化[12]。相比于正常细胞,前列腺癌细胞需摄取更多的脂肪酸用于维持细胞代谢活性。MATT等[13]敲除了前列腺癌细胞内CD36基因以抑制脂肪酸摄取,发现对前列腺癌有良好的治疗效果。VERMA等[14]发现抑制前列腺癌细胞摄取脂肪酸可以引发细胞能量代谢重编程,提高前列腺癌细胞对恩杂鲁胺的药物敏感性。近年来,脂代谢途径已证实是前列腺癌潜在的治疗靶点之一,极具发展前景。

本研究优选Elafibranor(ELA)作为一种新型的化疗药物,系统性评估了ELA对前列腺癌细胞生物学行为的影响及机制。与空白组(0 μmol/L)相比,高剂量组(15 μmol/L)中细胞增殖和迁移能力被显著地抑制,细胞凋亡率得到显著的增加,差异均具有统计学意义(P<0.05)。ELA是PPAR-a/δ的双重抑制剂。为此,我们检测了PPAR-a/δ通路中一系列下游基因的表达变化。结果显示:ELA可以有效地抑制脂肪酸的摄取(SCPX、PLTP),启动脂肪酸储存(PLIN2),并抑制脂肪酸氧化分解(PDK1、ACOX2)。ELA从多方面干预脂代谢途径,抗肿瘤机制较为清晰。

综上所述,ELA具有相对良好的体外抗肿瘤活性,且作用机制较为清晰。不足的是,ELA的临床有效性和生物安全性有待于进一步研究。目前,ELA已被美国食品药品监管局批准作为孤儿药用于治疗原发性胆汁性胆管炎。不难预测,ELA也将在前列腺癌化疗领域取得重要的临床转化成果。