miRNA和炎症因子在早产孕妇血清中的表达及临床意义

彭婷,张天蔚*,黄素静,钟业腾,林明冠

早产是指妊娠满28周至不满37周的分娩,是产科常见的不良妊娠结局之一,其发生的原因和机制不明,妊娠维持和分娩启动的异常均会导致早产的发生,全球每年约有1 300万早产儿出生,占所有新生儿的9.6%,是引起新生儿近远期并发症和婴儿死亡的主要原因[1-2],故早产不仅是严重的医学问题,同时也是严重的公众健康和社会问题。因此,了解早产发生过程中发挥关键作用的分子机制有助于临床上采取相应措施预防早产发生。既往研究认为,由白介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎性因子参与的感染性炎症反应是诱发孕妇早产的关键因素,但其具体的信号通路和分子调控机制仍未明确[3-7]。miRNA是由约22个非编码的核苷酸组成的小分子以调节RNA,通过与相应的转录RNA结合发挥其生物学效应,调控机体新陈代谢、增殖分化、生长凋亡等多种生理过程,同时miRNA也是机体重要的感染调控因子,炎性因子的活动离不开miRNA的参与,存在参与早产的理论基础[8-10]。本研究旨在探讨临产前孕妇血清miRNA和炎性因子表达水平与早产的相关性,以期为临床降低早产发生率,提高新生儿生存质量提供依据,也为后续早产机制研究提供新方向。

1 资料与方法

1.1 研究对象

纳入2021年6月至2022年6月在海南医学院第二附属医院产科行剖宫产手术的98例孕妇作为研究对象,根据不同妊娠结局分为足月产组和早产组。纳入标准:① 年龄20～35岁;② 孕周32～40周;③ 单胎妊娠。排除标准:① 伴有妊娠期高血压、妊娠期糖尿病、妊娠期心脏病、妊娠期脂肪肝等合并症的孕妇;② 因胎儿异常或畸形引产者;③ 因妊娠期合并症治疗性引产者;④ 有吸烟、酗酒等不良嗜好者;⑤ 双胎妊娠。

1.2 研究方法

1.2.1 临床资料收集 收集所有纳入研究孕妇的临床资料,包括年龄、体质量指数、文化程度、受孕方式、孕次、产次、孕周、有无胎膜早破等。

1.2.2 实验室检测 所有纳入研究的孕妇临产前取外周静脉血标本2份,1份做miRNA生物芯片分析,先对血样标本进行分离处理,获得 RNA沉淀物,加入100%乙醇,混匀后离心过滤,提取miRNA,以miRNA-200、miRNA-199、miRNA-26b、miRNA-34b、miRNA-34c、miRNA-338为目标基因。生物分光光度计(紫外分光光度法)测定样品OD值,荧光定量 PCR仪进行扩增,PCR反应采用10 μL反应体系,反应条件:95℃预变性15 min,然后 94℃变性 15 s、55℃退火 30 s 和 70℃延伸 30 s,共 45 个循环后反应结束,确认 Real-time PCR 的扩增曲线和融解曲线,进行 PCR 相对定量,其结果用 2-△△ct法计算目标基因的相对表达量。另1份静脉血标本,采用酶联免疫吸附法,测定血清炎症因子TNF-α、IL-8、IL-6表达水平。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 两组一般临床资料比较

符合入组条件的孕妇平均年龄(27.3±3.5)岁,其中足月产组68例孕妇,年龄 25～32 岁,平均(26.8±3.3)岁,初产妇 40例,经产妇 28例;早产组30例孕妇,年龄27～34 岁,平均(28.6±3.7)岁,初产妇16例,经产妇14例,两组孕妇文化程度、孕次、产次以及胎膜早破情况比较,差异有统计学意义(P<0.05),年龄、体质量指数等其他临床因素比较,差异均无统计学意义(P>0.05),详见下页表1。

表1 两组一般临床资料比较例(%)]

2.2 两组临产前血清炎症因子水平比较

早产组孕妇临产前血清TNF-α、IL-8以及IL-6表达水平明显高于足月产组,差异均有统计学意义(P<0.05),详见下页表2。

表2 两组临产前血清炎症因子水平比较

2.3 两组临产前血清miRNA比较

早产组孕妇临产前血清miRNA-26b表达水平高于足月产组,血清miRNA-199表达水平低于足月产组,差异有统计学意义(P<0.05),其他miRNA组间比较,差异均无统计学意义(P>0.05),详见表3。

表3 两组临产前血清miRNA 比较

2.4 影响孕妇早产的多因素Logistic回归分析

以孕妇不同妊娠结局作为因变量(足月产=0,早产=1),以单因素分析中有统计学意义的指标:文化程度(初中=1,高中=2,大学=3)、孕次(实际值)、产次(实际值)、胎膜早破(是=1,否=0)、TNF-α(实际值)、IL-8(实际值)、IL-6(实际值)、miRNA-26b(实际值)以及miRNA-199(实际值)作为自变量代入Logistic多因素模型进行分析,结果显示:在调整和控制混杂变量后,胎膜早破、TNF-α、IL-6以及miRNA-26b为影响孕妇早产的独立预测因素(P<0.05),详见表4。

表4 影响孕妇早产的多因素Logistic回归分析

2.5 ROC分析

以孕妇是否早产作为状态变量,对TNF-α、IL-6以及miRNA-26b进行ROC分析,结果显示,TNF-α、IL-6以及miRNA-26b对于孕妇早产均具有一定的预测价值(P<0.05),其中TNF-α预测孕妇早产的曲线下面积(AUC)为0.774(0.731～0.843),最佳诊断截点为55.1 ng/L,IL-6的AUC为0.821(0.764～0.941),最佳诊断截点为27.9 mg/L,miRNA-26b的AUC为0.852(0.821～0.935),最佳诊断截点为8.5×10-4,而联合预测的价值最高,AUC为0.932(0.879～0.968),见图1(彩插2)。

2.6 决策曲线分析

以TNF-α、IL-6以及miRNA-26b预测孕妇早产的净收益率作为纵坐标,高风险阈值作为横坐标,对3个独立预测指标进行决策曲线分析,结果显示,在实际阈值概率内,TNF-α、IL-6以及miRNA-26b预测孕妇早产均具有良好的净收益率,并且联合预测的净收益率高于单一指标,见图2(彩插2)。

3 讨论

早产为妊娠期最常见的并发症之一,其发病率也呈现逐年上升的趋势,据相关流行病学调查研究显示,由早产引发的各个系统并发症是新生儿死亡和低于 5 岁儿童死亡的最常见病因[11-12]。但目前关于早产的病因和发病机制尚未阐明,临床上对于早产也缺乏及时有效的干预措施。

miRNA是由约22个非编码的核苷酸组成的小分子调节RNA,通过与相应的转录RNA结合发挥其生物学效应,调控机体新陈代谢、增殖分化、生长凋亡等多种生理过程,而且在恶性肿瘤、糖尿病、心血管等疾病的发生发展中发挥关键作用,并且miRNA可以在血清和其他体液中稳定存在,表达谱随不同病理生理状态而改变[13]。早产的主要特征为妊娠子宫由静息至收缩表型转化导致提前不可逆的产程发动,而miRNA 被认为是子宫平滑肌转化过程中的重要调控分子。最近的研究表明,相较于足月产孕妇,早产孕妇血清中的确存在一系列异常表达的miRNA,在妊娠和分娩过程中,子宫肌层、子宫颈和胎膜均受到miRNA的调控和影响[14]。Ye等[15]研究发现P受体的下调表达导致转录抑制因子下调,诱导miRNA-199上调,且子宫收缩相关基因CX43上调表达,导致分娩启动。但是血清中与妊娠和分娩相关的 miRNA探索却没有获得广泛的关注,本研究发现,miRNA-26b在早产孕妇血清中异常高表达,多因素Logistic回归分析显示,血清miRNA-26b为影响孕妇早产的独立预测因素,并且随着临产前血清miRNA-26b表达水平升高,孕妇发生早产的风险也随之升高,其可能原因为:miRNA-26b作为机体重要的炎症和免疫调控因子,参与炎症因子和趋化因子的表达调控,血清中miRNA-26b异常高表达促进分娩过程中炎症因子向子宫平滑肌表达浸润,导致子宫平滑肌功能异常和感染性早产发生。目前已有研究表明,miRNA-26b在败血症等感染性疾病患者血清中异常高表达,并且其血清表达水平与败血症患者住院期间死亡率呈正相关[16-17]。Xu等[18]研究发现,miRNA-26b通过调控相关炎症因子及其合成产物,参与败血症等感染性疾病的发生发展以及疾病转归,但关于其与孕妇早产的相关性未见相关文献报道,本研究结果提示,临产前孕妇血清中miRNA-26b高表达可能导致子宫平滑肌功能异常和感染性早产发生,这有助于临床深入认识早产发生的分子机制。

Contreras等[19]研究认为,多种炎性因子如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α通过与相应的受体结合发挥其生物学效应,参与感染性早产的发生和分娩过程。Pinto等[20]研究发现子宫平滑肌组织中TNF-α表达上调与相应的受体结合可刺激上皮细胞和绒毛膜产生基质金属蛋白酶-1、3和前列腺素E2,引起胎膜破裂,宫缩发动。此外,分娩过程中IL-6表达上调并浸润至子宫平滑肌组织,可刺激催产素受体表达,并通过激活丘脑-垂体-肾上腺轴增加前列腺素的产生。本研究通过比较足月产组和早产组临产前的血清炎性因子表达水平发现:早产组临产前血清中TNF-α、IL-8、IL-6 表达水平均明显高于足月产组,多因素Logistic回归分析显示,TNF-α、IL-6 为影响孕妇早产的独立预测因素。其可能原因为:宫颈、宫内感染以及炎症反应是诱发早产的关键因素,而感染可引起TNF-α、IL-6 等炎症因子的大量释放,从而参与感染性早产的发生,但其具体调控机制仍需进一步的研究阐明。此外,本研究ROC分析和决策曲线分析显示,TNF-α、IL-6、miRNA-26b作为孕妇早产的独立预测因子均具有较高的预测效能和净收益率,进一步证实了本研究结论。

综上所述,TNF-α、IL-6以及miRNA-26b在早产孕妇血清中明显高表达,三者用于预测孕妇早产具有较高价值,且联合预测的预测效能和净收益率最高。但本研究为样本量较小的单中心研究,研究结果仍有待更多前瞻性大样本多中心研究进一步验证。