蛋白质组学筛选差异表达蛋白在子宫内膜癌中的研究进展

马建红,高亚婷,马怡彤,刘畅

子宫内膜癌(endometrial carcinoma,EC)是全球女性第四大恶性肿瘤[1],也是我国女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,发病率仅次于宫颈癌。I型子宫内膜样腺癌(endometrioid endometrial cancer,EEC)占EC的90%以上,通常级别低、诊断早、预后好,发病与雌激素过量、肥胖和非典型增生有关。II型非子宫内膜样癌(non-endometrioid endometrial cancer,NEEC)包括浆液性癌(serous endometrial cancer,SEC)、透明细胞癌和癌肉瘤等罕见组织学类型,具有高级别、高侵袭性、高复发、高死亡率等特点,其发病与雌激素无关。80%的EC患者在疾病早期诊断,以低级别EEC较为常见,5年生存率达90%[2],而晚期确诊患者复发和转移风险增高,5年生存率不足20%[2]。由于预期寿命延长、肥胖和代谢综合征等因素,EC的发病率和死亡率呈持续上升趋势,预计到2025年,全球新增病例和死亡人数将分别增加20.3%和17.4%[3]。因此,探究EC早期筛检、监测治疗反应及评价预后的诊疗手段迫在眉睫。

目前针对EC仍沿用传统诊断方法,包括临床症状、妇科检查、经阴道超声检查、子宫内膜活组织病理检查以及宫腔镜等,临床症状以绝经后异常子宫出血(abnormal uterine bleeding,AUB)最为常见,90%的EC患者可出现AUB,但该症状缺乏特异性,许多良、恶性妇科疾病均可发生,仅有10%～15%的AUB患者确诊为EC[4- 5]。辅助检查多在临床症状出现后,病理活检为诊断的金标准,但因具有侵入性,存在子宫穿孔、感染和出血等风险,不适用于常规筛查,理想的检测方法应简单、无创,高效、精确地筛检出全部早期患者,并且适用于筛查高危无症状女性,如EC风险极高的林奇综合征患者。早期诊断不仅能选择积极有效的治疗措施,还可为年轻患者保留生育功能创造机会。本文拟从已发表的文献入手,寻找具有临床应用价值的生物标志物,尝试为EC早期诊疗提供科学基础。

蛋白质组学是一种研究生物体内蛋白质的表达、结构、功能、定位、相互作用和修饰等特征的方法,可以反映病理情况下细胞中蛋白质的实时变化,为疾病的病因学研究提供高通量、高灵敏度的技术策略,为疾病的早期诊断、治疗和预后监测提供可靠的技术支持,成为探索基因功能和理解复杂生理病理过程最重要的方法之一[6]。在肿瘤研究中,蛋白质组学提供癌细胞内全部的蛋白质信息,协助阐明肿瘤发生的分子机制,在筛选具有诊疗价值的差异蛋白质方面显示出巨大潜力。本综述将介绍应用蛋白组学发现EC生物标志物的最新研究进展,描述质谱技术样本来源的优劣势,提出从单一标志物转向蛋白质组学的研究,开发2种或2种以上蛋白质组合以提高筛检准确性的新策略,以期为未来EC生物标记物的亚群研究奠定基础。

1 蛋白质组学的标本来源

将无创或微创采样方法与高通量蛋白质组学相结合以提高筛检的时效性,不仅能准确识别早期患者,而且易于在临床实践中操作。为寻找EC的生物标志物研究的人体标本,分析了包括血液、尿液、子宫灌洗液、宫腔抽吸物、子宫内膜活检组织和手术切除病理组织等不同来源标本及其优缺点[7],详见下页表1。

表1 蛋白质组学分析中不同标本来源及其优缺点

血液和尿液等体液标本是首选的标本来源,但疾病早期体液中肿瘤相关蛋白的浓度较低,变化不明显,使用医院常规检测技术不易检出,这种标本存在灵敏度和特异度差的问题[7]。子宫内膜活检和手术切除病理组织等是蛋白组学研究的可靠标本选择,但存在有创、不宜普筛、标本获取难度大等缺点[7-8]。早期病变组织的蛋白质变化不一定出现在血液和尿液中,但由于子宫腔与下生殖道的解剖连续性,内膜组织和子宫腔液体的蛋白质变化可能保持一致,从临床病理组织中筛选的差异蛋白转向易于获取的子宫腔液体进行验证,以求在疾病早期采集的无创或微创样本中寻找理想的生物标志物,这使蛋白质组学标志物鉴定可能为临床EC的诊疗提供新思路和新方向。

2 蛋白组学生物标志物

2.1 筛检标志物

2.1.1 活检或手术病理标本 研究证实S100家族与EC关系密切,S100A4/非肌球蛋白II信号转导参与调控子宫癌肉瘤的上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)进程和干细胞特性[9];S100A8和S100A9在淋巴结转移癌中发挥抗菌肽作用[10];S100A4增强ALDH1介导的癌细胞增殖和侵袭能力,与微囊性、伸长伴碎片状浸润(简称MELF浸润,此种浸润模式的EC易出现深肌层浸润、淋巴脉管间隙浸润和淋巴结转移)类型相关[11]。在EC中,这些S100亚型表达升高,检测其水平变化可以筛检早期患者。

在多项蛋白质组学中发现蛋白激酶家族参与EC的早期发生,联合检测可提供诊断信息,其中蛋白激酶PAK1通过改变肌动蛋白的骨架结构、细胞形状和黏附动力学,在癌细胞早期侵袭和转移中发挥作用[12]。Raglan等[12-13]发现Weel作为一种细胞周期蛋白磷酸化的蛋白激酶,诱导细胞分裂停滞在G2-M期以完成DNA损伤修复,但负向调节有丝分裂促进因子可引起有丝分裂异常、抵抗DNA损伤修复和诱导凋亡等恶性过程。研究证实CDC25A作为CDC25磷酸酶家族的一员,参与调控细胞周期G1/S转化,细胞分裂、增殖,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活化、DNA复制等多种生物学过程,其表达升高与EC的浸润和分化差有关[14]。

2.1.2 子宫抽吸物标本 Martinez等[1]采用子宫抽吸物进行蛋白质组学分析,以鉴别EEC和SEC亚型,筛选出2个蛋白质组合,第一组由MMP9和KPYM组成,MMP9高表达参与肿瘤起始驱动和细胞外基质降解,为癌细胞迁移、侵袭创造条件[15];KPYM是糖代谢的限速酶之一,参与肿瘤细胞有氧糖酵解和基因转录调控[16],MMP9和KPYM联合筛检EC的灵敏度为94.2%,特异度为87.2%。另一个筛检组合由3种上调蛋白质构成,CTNNB1调控细胞间黏附和WNT信号通路关键基因的转录,仅在EEC标本中检出,具有良好的亚型鉴定作用[17];CAPG通过重塑肌动蛋白调节细胞运动,参与癌细胞迁移和侵袭过程,侵袭性更强的SEC中表达水平更高[1];XPO2调节细胞有丝分裂检查点,缺失可抑制细胞周期进程,使肿瘤增殖、侵袭和转移能力下降,高表达与高分级和不良预后密切相关[1]。CTNNB1、XPO2和CAPG联合诊断的灵敏度为95.0%,特异度为95.9%。

2.2 治疗标志物

2.2.1 活检或手术病理标本 应用蛋白质组学鉴定的EC治疗靶点以结构蛋白居多,研究表明SPP1和ANGPT2参与肿瘤血管生成[6],SPP1增强血管内皮细胞的迁移能力,在VEGF诱导的血管生成中发挥重要作用;ANGPT2作为分泌型细胞因子家族的一员,参与血管重塑、伤口修复、肿瘤血管生成等生物学过程,针对SPP1和ANGPT2可研制抗肿瘤血管的靶向药物。Fata等[18]证实AnxA4诱导胞膜融合进而促进Cl-和胞外分泌,并且通过铜转运蛋白促进铂类药物外排造成化疗耐药,成为铂耐药患者有前景的治疗靶点。Ceylan等[19]发现CALR是一种调控免疫细胞凋亡的内质网蛋白,由于癌细胞抵抗凋亡,在疾病晚期表达下降,诱导其表达以促进癌细胞凋亡,提示其作为治疗靶点的临床价值。

调节生物过程的功能蛋白也可作为EC的治疗靶点,Ceylan等[19]发现ACTG1表达上调促进癌细胞迁移、侵袭和转移而加速肿瘤恶化,但该蛋白在EC早期升高、晚期下降,猜测表达减少与细胞分化和恶性侵袭有关,诱导其表达可能为患者提供治疗策略。Dieters等[20]证明KIAA1324是一种与孕激素受体共表达的雌激素诱导蛋白,高表达患者对激素治疗反应良好,为性激素相关EC的辅助诊断、内分泌治疗提供依据,并预示预后良好。

2.2.2 子宫灌洗液标本 在EC患者的子宫灌洗液中,与铁死亡相关的脂质抗氧化剂、谷胱甘肽合成酶、铁死亡抑制蛋白和铁转移受体蛋白等调控蛋白均表达上调,而坏死负调控因子表达下降,提示可将这些细胞死亡程序调控蛋白用作诱导癌细胞死亡的靶点[21]。

2.3 预后标志物

2.3.1 活检或手术病理标本 与EC预后相关的蛋白标志物主要是癌基因和抑癌基因的编码蛋白,Dou等[22-23]证明癌基因ERBB2参与细胞核转录调控,促进蛋白质合成和细胞生长,过表达与EC的高分级、高分期、NEEC组织学及总生存期(overall survival,OS)下降等不良预后相关,ERBB2也是SEC的治疗靶点。Dou等[22,24]证实抑癌基因PTEN是EC中最常见的突变基因,通过调控Akt-mTOR信号通路在细胞周期和细胞存活中发挥作用,疾病早期PTEN表达下降提示预后良好。抑癌基因TP53也是肿瘤中突变率最高的基因之一,调控细胞周期、生长阻滞和凋亡过程,激活氧化应激诱导细胞坏死[25]。在EC中TP53表达水平也用于癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)分子分型[22],过表达与高级别EEC和SEC存在相关性。

功能蛋白也可预测EC患者的预后,Tahara等[26]发现SDPR参与构成细胞外囊泡,通过ILK调控ALDH1的表达,与癌细胞迁移、EMT、集落形成、分化差、淋巴转移和MELF浸润等侵袭表型密切相关。Gonzlez等[27-28]发现编码E-钙黏蛋白的CDH1基因参与调控细胞黏附,诱导EMT进程以促进癌细胞增殖、迁移和侵袭等过程,该蛋白表达下调与不良预后、生存差密切相关。Kandoth等[28]发现MMR蛋白作为DNA错配修复系统的组成部分,由MLH1启动子甲基化引起表达缺失,可定义TCGA分型中的微卫星不稳定型(microsatellite instability,MSI),组织学表型归为I型EC,预后较好。Kandoth等[28-29]证明ESR1和PGR参与调节真核生物基因表达,影响细胞增殖和分化,表达阳性多见于I型EC,采取内分泌靶向治疗后预后良好,但表达阴性患者淋巴结转移风险增高且预后变差。

多项研究探讨L1CAM的致癌机制,发现其在包括SEC和透明细胞癌在内的高级别EC中表达升高,调控细胞黏附、诱导EMT、淋巴脉管浸润并预测不良预后,L1CAM是迄今为止发现的预测复发和死亡最敏感的预后因子[30-31]。在FBXW7突变的高危型EC中,L1CAM与癌细胞增殖、迁移、运动和细胞连接等恶性行为有关,表达增加导致OS和无病生存期下降[30],还可用作单克隆抗体、放射免疫等治疗的优势靶点[32]。

2.3.2 血液标本 MUC16和WFDC2是EC最具诊断和预后价值的血液标志物,最初MUC16是用于卵巢癌诊断的上皮性抗原,后来发现也具有EC诊断和预测淋巴结转移的价值[2,33]。WFDC2预测淋巴结转移和肌层浸润情况,现将两者联合检测可明显提高预后判断的灵敏度和一致性[2,34]。Uyar等[35]假设手术前后患者血液蛋白质变化是由肿瘤存在引起的,对比术前和术后血液蛋白质组学差异,识别反映手术相关的特定蛋白质,发现FAM83D仅在手术前的血液样本中存在,表达强度与分级和分期呈正相关,随着FAM83D表达增加,患者DFS和OS均降低,因此FAM83D可能是EC的预后靶点。蛋白质标志物参与恶性行为的概括详见下页表2。

3 总结与展望

本文对比了蛋白质组学研究中不同标本的优缺点,提出从最常见的病理活检或手术切除标本中筛选出潜在标志物,接下来在体液中(如血液或宫腔灌洗液)验证其表达与EC的相关性,将有创检查转化为无创或微创操作,表2中黑体部分为参与恶性行为超过5项或在多项研究中被提及的标志物,未来可开展大规模、多中心的临床试验鉴定其临床应用价值。其次,文中提及的部分标志物,如MUC16和WFDC2作为血液标志物已在临床广泛应用;CTNNB1、PTEN和TP53等用于TCGA分子分型;MMP9、KPYM与CTNNB1、XPO2、CAPG等两组标志物具有诊断价值,可进一步明确临床实用性;其余多数研究尚处于前期试验阶段,未来可开展临床课题验证其可靠性,检测其表达将改变现行的诊疗标准,可更早期、精准地预测肿瘤进展,在疾病早期采取干预措施,减少不必要的侵入性检查和手术,减轻患者的痛苦和经济负担。

本文探讨了利用蛋白质组学技术筛选EC生物标志物的研究进展,甄选已被证实参与EC发生和进展的蛋白质阵列,按照参与的恶性生物学过程进行归类,为后续蛋白质组合研究提供有参考意义的科学数据,并探究不同生物标本的优缺点,为未来开发简单、易操作的检测技术奠定基础。随着组学技术不断发展和完善,将来有望整合基因组学、转录组学、蛋白组学、代谢组学及免疫组学等多组学研究,全面阐明EC的病因学和病理机制,并针对发病机制实施以靶向治疗为主的综合管理措施,为精确筛检、精准施治进而治愈癌症患者创造希望和契机。

作者贡献声明:马建红参与相关文献的收集、整理及论文撰写;高亚婷、马怡彤参与文献的筛选、整理及分析;刘畅为项目构思者及负责人,指导写作及论文修改。

利益冲突作者声明无任何利益冲突。