特应性皮炎患儿血浆外泌体LncRNA MIR155HG表达与病情严重程度的相关性
2023-09-26刘岩凌琬茗赵瑞雪王浩
刘岩,凌琬茗,赵瑞雪,王浩
特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)是一种多发于儿童且发病率较高(10%~17%)的慢性炎性皮肤病,若诊断不及时可能继发脓疱感染,甚至导致红皮病的发生[1-2]。AD可能与遗传、免疫系统、环境等多个方面有关[3-4]。近年来分子生物标志物在临床应用中的研究越来越多,因此,寻找可靠的分子生物学指标对于AD的临床早期识别及预后改善十分重要。外泌体广泛分布于各种体液,对机体自身免疫疾病具有调节作用,且参与细胞生物学行为及组织修复等过程,取少许样品即可在临床上用于分析研究,且检测标本容易获取、创伤较小[5]。长链非编码RNA(Long noncoding RNA,LncRNA)是一种长度>200个碱基的反义RNA分子,在免疫疾病的发病和进展中发挥重要作用[6-7]。唐敏等[8]研究表明,LncRNA MIR155HG与系统性红斑狼疮等免疫系统疾病有关。目前在AD患儿血浆外泌体中LncRNA MIR155HG的表达相关的报道较少。基于此,本研究检测并比较LncRNA MIR155HG在AD患儿与健康儿童血浆外泌体中的表达差异,并以此为基础分析其与病情进展之间的关系,期望为AD的临床早期及时控制提供参考,报道如下。
1 资料与方法
1.1 临床资料 选取2021年12月—2023年1月于河北省儿童医院皮肤科就诊的AD患儿118例(AD组)为研究对象,男58例,女60例,年龄1~14(6.72±3.36)岁,病程(2.11±0.47)年。以急性湿疹为主,表现为亚急性和慢性皮损,皮疹干燥肥厚,呈苔藓样变,发生于面颈、腘窝、肘窝、小腿等部位。另选同期健康体检儿童120例作为健康对照组,男62例,女58例,年龄1~13(6.51±3.15)岁;排除标准:(1)测试当日有化妆品或护肤品使用;(2)近1周使用过抗生素;(3)存在皮损。AD组和健康对照组儿童性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会研究同意(LS临床20210106),受试者监护人知情同意并签署知情同意书。
1.2 病例选择标准 (1)纳入标准:①符合AD诊断标准[9];②测量部位无皮肤损伤;③近1个月无糖皮质激素、抗生素及免疫抑制剂等使用史;④无其他基础病、合并症及家族遗传史。(2)排除标准:①其他自身免疫性疾病;②感染性疾病;③恶性肿瘤。
1.3 观测指标与方法 收集患儿确诊后第2天、健康者体检当天空腹静脉血4 ml,肝素抗凝后,离心留取血浆,-70℃储存待测。
1.3.1 血浆外泌体提取:(1)使用外泌体提取试剂盒(涿州捷融生物科技有限公司)分离血浆外泌体,磷钨酸染色外泌体后,以透射电镜(型号JEM-1230,长春百克生物科技股份公司)进行结果分析。(2)外泌体颗粒浓度采用纳米粒度仪(型号Zetasizer,长春市中保牧生物科技有限公司)进行测定,样品稀释5 000倍,按照纳米粒度仪操作说明设置检测参数进行测量。(3)获取血细胞、外泌体样品、血浆,提取总蛋白,定量100 μg蛋白后,进行电泳、转膜、封闭操作,分别加入外泌体表面标志蛋白[CD9(1∶670)、CD63(1∶710)、TSG101(1∶710)、Calnexin(1∶690)](涿州捷融生物科技有限公司)一抗孵育20 h,添加羊抗兔二抗(1∶1 630)(河南祺祥科技生物有限公司)孵育3 h后,ECL试剂显色,凝胶成像系统(型号SH-1720,长春市中保牧生物科技有限公司)拍照。
1.3.2 荧光定量PCR(qRT-PCR)法测定血浆外泌体LncRNA MIR155HG表达水平:血浆外泌体总RNA采用TRIzol试剂(涿州捷融生物科技有限公司)提取,反转录试剂盒(河南祺祥科技生物有限公司)进行逆转录,得cDNA。使用qRT-PCR仪(型号eQ164CP,长春百克生物科技股份公司)并参照PCR试剂盒(SYBR Premix Ex Taq)(涿州捷融生物科技有限公司)说明进行qRT-PCR反应,反应体系30 μl:SYBR Premix Ex Taq 18 μl,cDNA 2 μl,H2O 9 μl,上下游引物各0.5 μl。反应条件:92℃ 19 s、91℃ 17 s、57℃ 23 s、74℃ 18 s,共循环32次。LncRNA MIR155HG、GAPDH引物均由长春百克生物科技股份公司合成,LncRNAMIR155HG上游引物:5’-TGCGGCAAAGTGCT-TACAGTG-3’,下游引物:5’-CCAGTGCAGGGTCCG-AGGT-3’;GAPDH上游引物:5’-GAAGGTGAAGGTC-GGAGTC-3’,下游引物:5’-AAGATGGTGATGGG-ATTTC-3’。以2-ΔΔCt法计算LncRNA MIR155HG相对表达量。
1.3.3 AD积分指数(SCORAD)评价:对所有AD患儿进行SCORAD评分,SCORAD评分(0~103分)包含:皮损范围(A)、皮损严重程度(B)、瘙痒和影响睡眠程度(C)。SCORAD总分计算公式为A/5+7B/2+C,评分越高表示AD病情越严重。依据评分分为轻度亚组(41例,评分<25分)、中度亚组(38例,25分≤评分≤50分)、重度亚组(39例,评分>50分)[9]。
2 结 果
2.1 血浆外泌体鉴定 (1)透射电镜显示:圆形脂质双层膜囊状颗粒直径约140 nm,且清晰可见,见图1。(2)纳米粒度仪检测结果显示:颗粒直径为30~195 nm,单峰正态分布(峰值约54 nm),见图2。(3)免疫印迹法显示:外泌体样品中外泌体标志蛋白(CD63、CD9、TSG101)表达较稳定,Calnexin蛋白表达不稳定,见图3。表明纯化样品中外泌体颗粒大量存在。
图1 血浆外泌体透射电镜结果(磷钨酸染色,×10 000)Fig.1 Transmission electron microscopy results of plasma exosomes (stained with phosphotungstic acid, × 10 000)
图2 血浆外泌体纳米粒度仪检测结果Fig.2 Detection results of nanoparticle analyzer for plasma exosomes
图3 血浆外泌体蛋白免疫印迹检测结果Fig.3 Immunoblotting test results of plasma exosomes protein
2.2 2组血浆外泌体LncRNA MIR155HG表达水平比较 AD组血浆外泌体LncRNA MIR155HG表达水平高于健康对照组(2.85±0.85 vs.1.00±0.00,t/P=23.843/<0.001)。
2.3 3亚组血浆外泌体LncRNA MIR155HG表达水平、SCORAD评分比较 轻度亚组、中度亚组、重度亚组AD患儿血浆外泌体LncRNA MIR155HG表达水平、SCORAD评分依次升高(P均<0.01),见表1。
表1 不同严重程度AD患儿血浆外泌体LncRNA MIR155HG表达水平及SCORAD评分比较Tab.1 Comparison of plasma exosomes LncRNA MIR155HG expression levels and SCORAD scores in children with different severity of AD
2.4 血浆外泌体LncRNA MIR155HG与SCORAD评分的相关性 AD患儿血浆外泌体LncRNA MIR155HG与SCORAD评分呈正相关(r=0.673,P<0.001)。
2.5 血浆外泌体LncRNA MIR155HG对中度、重度AD的诊断价值 ROC曲线分析结果显示,血浆外泌体LncRNA MIR155HG诊断中度AD的曲线下面积(AUC)为0.831(95%CI0.758~0.935),截断值为2.13,敏感度为0.741,特异度为0.916,约登指数0.657;诊断重度AD的AUC为0.802(95%CI0.704~0.891),截断值为3.31,敏感度为0.715,特异度为0.817,约登指数0.532;诊断中度和重度AD的AUC比较差异无统计学意义(Z/P=1.008/0.313),见图4。
图4 LncRNA MIR155HG诊断中度、重度AD的ROC曲线Fig.4 ROC curve of LncRNA MIR155HG in diagnosing moderate and severe AD
3 讨 论
AD又被称作可遗传的过敏性皮炎,是多见于儿童及青少年的皮肤病,常表现为皮肤大面积红斑、丘疹、顽固性瘙痒及皮肤干燥等症状,其发病可能与遗传、免疫、环境及精神等因素有关[10]。临床尚无特效治疗方法,由于易复发、易骚痒等特征,其会对患儿及家属造成严重影响[11-12],因此临床急需可辅助诊断的分子生物标志物。
外泌体由细胞释放,作为最小的细胞外囊泡之一,其密度为1.10~1.18 g/ml。细胞内溶酶体微粒形成的多囊泡体受刺激后与质膜融合,导致外泌体的释放,外泌体相关蛋白CD9、CD63等均会在此过程被转运[13-14]。本研究首先提取鉴别外泌体,染色后观察(透射电镜),可见圆形脂质双层膜囊状颗粒,直径约为140 nm。纳米粒度仪检测结果显示颗粒主要分布于30~195 nm,且分散均一,直径呈单峰正态分布曲线,峰值约在54 nm处。免疫印迹检测结果显示,CD63、TSG101、CD9外泌体标志蛋白在外泌体样品稳定表达。表明纯化样品中外泌体颗粒的存在。
外泌体能够携带不同的具有生物活性的蛋白质、脂质及核酸[信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、LncRNA、DNA等],并能有效地将此类活性物质运输至不同的受体细胞,从而改变受体细胞的生物活动[15-17]。MIR155HG是人染色体9p21上的高度保守重要LncRNA,也是微小RNA-155(miR-155)的宿主LncRNA,miR-155作为其前体序列与免疫系统疾病发生发展关系密切[18]。卢山明等[19]研究发现,与健康人比较,血虚风燥型AD患者血清miR-155水平明显升高。唐敏等[8]研究发现,自身免疫性疾病系统性红斑狼疮患者血清中LncRNA MIR155HG水平明显高于健康对照组,且与疾病活动度有关,提示LncRNA MIR155HG可能为系统性红斑狼疮疾病活动度评估及预后判断的分子标志物。因此推测LncRNA MIR155HG与免疫系统疾病AD的发生有关。本研究结果显示,AD患儿血浆外泌体LncRNA MIR155HG表达水平较健康儿童更高,且随严重程度的增加逐渐升高。与上述相关研究趋势一致,说明患儿血浆外泌体LncRNA MIR155HG的异常升高可能参与AD的发生与进展,分析原因,LncRNA MIR155HG及其前体序列miR-155可对AD患儿机体炎性因子进行调控,从而参与免疫应答反应。SCORAD评分是AD评估常用标准,可用于AD患者病情严重程度的评估[20]。此外,在本研究中AD患儿LncRNA MIR155HG与SCORAD评分呈正相关,进一步表明血浆外泌体LncRNA MIR155HG异常升高可能参与了AD病情的进展过程,LncRNA MIR155HG表达水平越高则表明病情越严重。为进一步探究血浆外泌体LncRNA MIR155HG表达水平与AD严重程度的关系,本研究分析了LncRNA MIR155HG的诊断价值,结果显示血浆外泌体LncRNA MIR155HG表达水平诊断中度、重度AD的AUC分别为0.831、0.802,截断值分别为2.13、3.31,敏感度分别为0.741、0.715,特异度分别为0.916、0.817。表明血浆外泌体LncRNA MIR155HG对AD严重程度有较高的诊断价值,临床上要关注血浆外泌体LncRNA MIR155HG高于2.13、3.31的AD患儿,这类患儿容易发展为中度、重度AD。
综上所述,AD患儿血浆外泌体LncRNA MIR155HG高表达,且其可能与AD病情的严重程度有关,定时监测其表达变化可用于AD患儿的病情评估。但关于LncRNA MIR155HG作用于AD患儿的具体机制仍需后续深入探索。
利益冲突:所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明
刘岩:设计研究方案,课题设计,实施研究过程,论文撰写;凌琬茗:提出研究思路,分析试验数据,论文审核;赵瑞雪:实施研究过程,资料搜集整理,论文修改;王浩:进行统计学分析