韭菜子皂苷的提取与抗疲劳作用

达热卓玛 徐一达 沈 婧

（1.海西州疾病预防控制中心业务科，青海 海西蒙古族藏族自治州，817000；2. 江南大学食品学院，江苏 无锡，214122）

韭菜子是百合科葱属韭（Allium tuberosum Rottler ex Sprengle.）的种子，又名韭子。质硬，气特异，味微辛[1]。具有温中、补虚、益阳、调和脏腑的作用[2-4]。被卫生部列为保健品之一，国内外对韭菜子的研究很少，且大多以韭菜子抗菌、抗氧化等为主[5-7]。从我们掌握的文献资料来看，国外还未对韭菜子进行过甾体皂苷抗疲劳功效方面的研究，国内也鲜有研究。本研究对韭菜子中的皂苷成分进行了提取和鉴别，并探讨了其抗疲劳作用，为韭菜子甾体皂苷用于临床抗疲劳作用提供一定依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

韭菜子：购于安徽亳州药材市场。实验动物：昆明小 白鼠［生产企业：上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SYXK (苏) 2012-0002］，雌雄各半，每只（20±5）g；饲养环境：屏障环境，清洁级（小鼠）。无水乙醇、硫酸、茴香醛、冰醋酸、乙酸乙酯、石油醚（30 ～60℃）、正丁醇等分析纯有机试剂（生产企业：国药集团化学试剂有限公司）；氢化可的松（生产企业：太极集团西南药业股份有限公司生产，批号：090103）；血乳酸试剂盒（生产企业：艾莱萨生物科技有限公司，批号：E20200101A）；对照品：实验室分离得到；MCI色谱柱（10150 cm）（生产企业：日本三菱化学公司）。

1.2 仪器与设备

植物粉碎机（生产企业：常州市金球设备有限公司）、旋转蒸发仪（生产企业：上海申顺生物科技有限公司）、循环水式多用真空泵（生产企业：郑州长城有限公司，型号：SHB-BB型）、恒温油水浴锅（生产企业：江苏金怡仪器科技有限公司，型号：YD2A）、精密电子天平（生产企业：瑞士梅特勒，型号：ME104E）。

2 实验方法

2.1 韭菜子中皂苷的鉴别

2.1.1 样品提取

将10 kg干燥的生品韭菜子粉碎，经40目过滤筛，放入提取罐，用6～8倍量50%乙醇回流提取2 h，冷却，过滤，上清液浓缩干燥至无醇味，上样 MCI色谱柱（10×150 cm），先用离子水，10%乙醇、45%乙醇、70%乙醇和90%乙醇梯度洗脱，70%乙醇部位以甾体皂苷为主，鉴于此，收集70%乙醇部位，减压浓缩干燥待用[8-10]。

2.1.2 样品定性检测

醋酐-浓硫酸反应（Liebermann-Burchard），在试管中将

2.1.1 中得到的浓缩物少量溶于乙酸酐，再沿试管壁加入浓硫酸，观察并记录[11]。

五氯化锑反应(Kahlenberg)，将少量2.1.1中得到的浓缩物与五氯化锑的氯仿溶液反应，观察颜色变化。

三氯醋酸反应(Rosen-Heimer)，将2.1.1中得到的浓缩物制成溶液滴在滤纸上，加三氯醋酸试剂一滴，加热，进行观察记录[12]。

2.2 韭菜子中皂苷的提取工艺

2.2.1 测定波长的选择

取对照品10 mg，用甲醇定容至10 mL，充分混匀使之溶解，得到对照品溶液，其浓度1 mg/mL。

用移液枪精密移取1.5 mL对照品溶液，真空蒸发至干，迅速用移液枪精准加入0.8 mL的高氯酸，0.2 mL的5% 香草醛-冰醋酸，于60 ℃水浴显色，15 min后流水冷却，加入5 mL冰醋酸，摇匀，以不加对照品的管为空白，立即在200～800 nm波长下扫描，测定吸光度，记录数据[13-14]。

2.2.2 标准曲线

取2.2.1配置的对照品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL于10 mL比色管中，挥干溶剂，加高氯酸至刻度，置25 ℃水浴中保温25 min，取出冷却至室温，显色，得质量浓度分别为0.002 mg/mL、0.004 mg/mL、0.006 mg/mL、0.008 mg/mL、0.010 mg/mL、0.012 mg/mL的溶液，以高氯酸为空白试剂，在454 nm处测量吸光度，回归分析[15-16]。

2.2.3 酒精浓度对皂苷提取率的影响

取6份准确称定的2 g韭菜子粉末置于5个干燥洁净150 mL具塞锥形瓶中，分别精密加入50 mL的水及30%、40%、50%、55%、60%乙醇溶液。恒温60 ℃，静置1 h过滤，提取3次，测定吸光度。

2.2.4 料液比对皂苷提取率的影响

取5份准确称定的2 g韭菜子粉末置于5个干燥洁净150 mL具塞锥形瓶中，分别精密加入12.5 mL、25.0 mL、50.0 mL、100.0 mL、200.0 mL的60%乙醇。恒温60 ℃震荡1 h，提取3次，取滤液，测定吸光度。

2.2.5 提取温度对皂苷提取率的影响

取7份准确称定的2 g韭菜子粉末置于150 mL具塞锥形瓶中，精密加入50 mL的60%乙醇，分别控制在恒温20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃下震荡1 h，提取3次，取滤液，测定吸光度。

2.2.6 提取时间对皂苷提取率的影响

取6份准确称定的2 g韭菜子粉末置于150 mL具塞锥形瓶中，精密加入50 mL 60%乙醇，分别恒温60 ℃ 1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h，静置过滤，提取3次，取滤液，测定吸光度。

2.3 韭菜子抗疲劳作用

2.3.1 建立阳虚小鼠模型

选取60只小鼠，6周龄，体重20～25 g，雌雄各半，适应性饲养1周，编号后随机分成3组，每组20只。除空白对照组外，余组肌注氢化可的松25 mg/kg，连续7 d［17-18］。

2.3.2 游泳力竭实验

造模后，将2.1中的样品按1 g/kg的剂量与纯净水制成混悬液灌胃治疗组，空白对照组、模型组给予等体积纯净水，连续10 d。末次给药后1 h，取每组10只尾部负重体重10%的铅丝，投入体积为35 cm×33 cm×20 cm、水温为（28±1）℃的圆形玻璃缸内，头部无力游出水面7 s记录为游泳时间（即抗疲劳时间）；另外每组10只尾部负重体重4%的铅丝，投入体积为35 cm×33 cm×20 cm、水温（28±1）℃的圆形玻璃缸中，游泳10 min，休息15 min后眼球采血，测定血清中的乳酸值。

2.4 统计学分析

建立数据库，应用SPSS 19.0 软件进行统计学分析，计量资料用（±s）表示，根据正态分布检验方差齐性，选择单因素方差分析（one-way ANOVA）检验，组内比较采用最小显著性差异法（LSD），检验水准α=0.05。

3 结果

3.1 韭菜子中皂苷的鉴别

醋酐-浓硫酸反应（Liebermann-Burchard），观察发现呈黄-红-紫-蓝-绿色等变化，最后褪色。

五氯化锑反应（Kahlenberg），将2.1.1中得到的浓缩物少量与五氯化锑的氯仿溶液反应，干燥加热60 ℃时显紫色。

三氯醋酸反应（Rosen-Heimer），加热后滤纸上生成红色并渐变为紫色。在同样实验条件下，三萜皂苷加热100 ℃才会生成红色，再变为紫色，而样品反应更快，加热至60 ℃即呈红色，之后变为紫色，由此推测样品含甾体皂苷。

皂苷水解成苷元、羟基脱水成双键、双键移位、分子间缩合、使脂环上产生共轭双键而与浓硫酸等反应呈现多种不同的色调，或在紫外光下呈现荧光。显色反应的快慢主要决定于脂环上原来存在的双键的多少、羟基的多少，脂环上原有共轭双键的呈色很快，环上只有孤立双键的呈色慢，完全饱和、羟基又少的不呈色。甾体皂苷的显色反应比三萜皂苷快，因为三萜脂环上的碳原子甲基取代多而变化稍慢，显示韭菜子70%洗脱液中含有甾体皂苷。

3.2 韭菜子中皂苷的提取工艺

3.2.1 测定波长的选择

见图1，标准品在454 nm附近处出现峰型稳定的次高峰，而韭菜子提取液也在454 nm波长附近出现了峰型单一的次高峰，经多次扫描，峰型稳定，漂移较小，可以认为是同一物质，由此将454 nm作为韭菜子中皂苷的测定波长。

图1 200～1000nm韭菜子提取液皂苷吸光度曲线

3.2.2 酒精浓度对皂苷提取率的影响

乙醇浓度在0%到50%期间皂苷提取率随着度数的增加而增大，当50%时提取效果最好，而超过50%后，提取率开始降低，见图2。

图2 不同乙醇浓度提取皂苷的提取率

3.2.3 料液比对皂苷提取率的影响

料液比在1:6.25到1:200范围内，随着溶剂量的增加，提取率递增，见表1。料液比越大，表明细胞液与胞外溶剂间的浓度差越大，活性物质的扩散速率也就越快。鉴于后期的浓缩成本及工艺复杂性等因素，在料液比为1:12.5至1:25区间的皂苷提取率趋于平稳。

表1 不同料液比对韭菜子中皂苷提取率的影响

3.2.4 提取温度对皂苷提取率的影响

见图3，随提取温度的增加，皂苷的提取率显著上升。这是由于温度升高皂苷溶于乙醇时吸收热量,根据平衡移动原理,当温度升高时,平衡有利于向吸热的方向移动。在这期间，皂苷的提取率随温度升高而增大，但温度达到60 ℃后提取率开始降低。

图3 韭菜子不同提取温度皂苷提取率

3.2.5 提取时间对皂苷提取率的影响

见图4，提取时间越长，皂苷提取率越高，而4 h之后达到一定的稳定状态，往后时间对提取率的影响并不大。

图4 韭菜子在不同提取时间的皂苷提取率

3.2.6 最优条件分析

综合单因素实验结果，取六组平行样品， 测得 在乙醇浓度50%，温度60 ℃，料液比1:25，提取4 h，韭菜子总皂苷含量的均值为3.28%，见表2。

表2 韭菜子中总皂苷含量测定

3.3 韭菜子甾体皂苷对阳虚模型小鼠的影响

空白组、模型组、治疗组在小鼠游泳力竭时间和血乳酸含量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），为明确具体差异，经LSD法进行组内比较，得出模型组与空白对照组相比，小鼠游泳力竭时间显著减少，差异有统计学意义（P＜0.05），模型建立效果理想。治疗组与空白组 比较，小鼠游泳力竭时间 有增加，差异有统计学意义（P＜0.05），较模型组显著延长，差异有统计学意义（P＜0.05）； 模型组与空白组比较，血乳酸含量增加，差异有统计学意义（P＜0.05），治疗组与空白组比较，血乳酸含量降低，差异有统计学意义（P＜0.05），较模型组显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 韭菜子甾体皂苷对阳虚小鼠游泳时间和血乳酸（LAC）的影响（±s）

表3 韭菜子甾体皂苷对阳虚小鼠游泳时间和血乳酸（LAC）的影响（±s）

注：*P＜0.05，**P＜0.01；1=空白组，2=模型组，3=治疗组。

组别只数时间（s）血乳酸（mmol/L）空白细110325.57±36.036.81±0.55模型组210237.78±40.807.74±1.04治疗组310375.96±59.656.04±0.84 P＜0.001＜0.001 F 22.495** 10.385**LSD2＜1，3**；3＞1*，3＞2**2＞1*，3**；3＜1*，3＜2**

4 讨论

韭菜子提取物抗菌、抗氧化、抗疲劳作用已有大量文献报道[19-20]。为进一步明确韭菜子中抗疲劳的具体有效成分，此次研究将韭菜子提取物进一步分离，通过显色反应，鉴定韭菜子中的皂苷为甾体皂苷，并分析了不同酒精浓度、料液比、温度及提取时间对皂苷提取率的影响， 发现在50%乙醇，60 ℃，料液比1:25，提取4 h条件下韭菜子总皂苷含量的均值为3.28%，是最佳提取工艺条件。动物实验结果显示：模型组小鼠与空白对照组相比，小鼠游泳力竭时间显著减少 （P＜0.05）且血乳酸含量增加（P＜0.05），证明建模效果良好。 治疗组小鼠游泳力竭时间较模型组和空白组明显延长（P＜0.05），且治疗组小鼠血乳酸含量显著低于模型组（P＜0.05），提示 韭菜子甾体皂苷能显著降低小鼠运动过程中的乳酸堆积，从而缓解小鼠体力疲劳，提高小鼠的运动耐力，这与陶永梅[20]、闫东[21]的研究结果一致。韭菜子甾体皂苷降低血乳酸水平的机制主要考虑两个方面：根据《罗氏会约医镜》[22]中记载韭菜子入肝经、肾经，现代也有文献研究其有温补肝肾的作用,韭菜子中的甾体皂苷通过改善肝、肾功能，升高 Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶，促进小鼠体内的乳酸更快转变为葡萄糖或糖原[23-24]；二是通过降低MDA、NO含量，提高肝脏中T-SOD、GSH-PX 酶活力，使小鼠在相同强度的运动中可以利用更多的氧气，运动肌就会有更多的血氧供应，从而加速肌肉对乳酸的代谢，减少乳酸堆积。

韭菜是一种适应力极强的植物，在我国西部高海拔地区也有广泛种植，极具开发价值，希望通过以上研究能够为下一步研究开发韭菜子甾体皂苷类中药新药提供理论参考，使韭菜子食药领域得到更广阔的应用。另外，由于 分离工作量较大且耗时，单体化合物的药理活性和构效关系有望在今后得到进一步研究。