基于网络药理学探讨金钗石斛和霍山石斛治疗阿尔茨海默病的作用机制

李莉，宋琳，安淑荣，朴钟源，楚魏，柯秋怡

1.黑龙江中医药大学 基础医学院，黑龙江 哈尔滨 150040

2.惠州学院 生命科学学院，广东 惠州 516007

3.惠州市第三人民医院 广州医科大学附属惠州医院 神经内科二区，广东 惠州 516002

阿尔茨海默病是一种涉及认知功能障碍和精神行为异常的中枢神经系统退行性疾病，其早期临床表现为短期记忆障碍，伴有进行性加重，后期还会出现认知、判断和定向功能的异常[1-2]，对患者及其家庭造成了不可磨灭的影响，也大大加重了社会医疗负担。但是阿尔茨海默病的病理机制复杂目前尚未完全清楚，相继出现了以β-淀粉样蛋白（Aβ）、tau 蛋白、胆碱能损伤、免疫炎症和肠道微生物群等为代表的学说。随着全球老龄化的到来，阿尔茨海默病已经成为重大公共卫生问题。有研究表明，我国65 岁以上痴呆患病率6.6%，并呈每5 年增长1倍以上的趋势，80 岁以上老年人痴呆患病率也达到了22%，预计21 世纪中叶痴呆患者会随老年人口的增加达到2 000 万[3]。

金钗石斛DendrobiumnobileLindl.、霍山石斛D.huoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng 同属于兰科石斛属药用植物，历史悠久。《神农本草经》记载石斛补五藏，虚劳羸瘦，强阴，长期服用可以厚肠胃，达到轻身延年的功效。《名医别录》记载：“益精，补内绝不足，平胃气，定志除惊”。《药性本草》记载石斛益气除热，可以健阳，补肾积精，益肾气，益力。现代研究表明，石斛具有保护神经、抗衰老等作用[4]。王龙海[5]、李菲等[6]发现石斛可以通过抑制神经元凋亡和tau 蛋白过度磷酸化、调节小鼠海马线粒体和突触等多种途径改善与年龄相关的记忆力下降，与阿尔茨海默病发病机制及主要临床表现高度契合。此外，金钗石斛主要成分为生物碱类、菲类以及联苄类等，而霍山石斛主要成分为大分子多糖及小分子物质联苄类、黄酮等，所以由于产地分布较为广泛，气候、温度、日照、水分、土壤等因素均会导致不同品种石斛中的有效成分、具体起作用的成分、作用靶点甚至作用通路都会存在一定程度差异，但这种差异尚未完全清楚，一定程度限制了临床治疗用药，所以探究金钗石斛与霍山石斛药用价值的差异有广泛的研究前景[6-11]。

网络药理学的优势在于从系统生物学理论出发，可以通过多成分、多靶点探究药物的作用机制，这种方法与中药具有复杂成分的特点高度契合，所以可以利用网络药理学构建石斛与疾病的“药物-活性成分-疾病-靶点”网络模型，可以揭示金钗石斛与霍山石斛中复杂的作用机制，进而从整体层面研究和把握中药对疾病的影响，对二者成分、作用靶点以及作用通路进行比较，其成果可为临床治疗用药、新药研发等提供思路和理论支持[12]。

1 材料与方法

1.1 中药活性成分的查找与筛选

通过中国知网、万方、PubMed 收集金钗石斛、霍山石斛成分[10-11,13-17]，在PubChem 数据库检索和ChemDraw20 软件中绘制金钗石斛和霍山石斛的化学分子结构式，保存各结构式（*sdf）的结构。将获得的结构图导入SWISS ADME 平台，按照符合满足“Gl absorption＝high”“可透过血脑屏障＝yes”以及满足类药性五原则的标准筛选中药活性成分。

1.2 预测中药活性成分的潜在靶点

将筛选出的符合要求的活性成分分别输入到SwissTartgetPrediction 数据库，下载活性成分相关信息，获得probability＞0 的靶点，将收集到的靶点进行整合、去除重复值等，分别获得金钗、霍山石斛活性成分的潜在靶点。

1.3 疾病靶点的收集

将“Alzheimer’s disease”输入到GeneCards 数据库进行检索，多次取中位数，最后选取relevance sore＞12 的靶点；输入到OMIM 数据库进行检索，获得所有阿尔茨海默病相关靶点，将二者进行分列、合并、去重处理，即获得相应疾病靶点。

1.4 药物成分及其预测靶点的比较

将金钗、霍山石斛的活性成分输入到Venny 2.1.0，做出金钗石斛与霍山石斛成分Venn 图；将金钗石斛、霍山石斛各自预测总靶点分别与疾病靶点输入到Venny 2.1.0 做Venn 图，即各自与疾病的交集靶点；将金钗石斛、霍山石斛各成分预测靶点分别与疾病靶点输入到Venny 2.1.0 做Venn 图；将金钗石斛-疾病交集靶点与霍山石斛-疾病交集靶点输入到Venny 2.1.0 做Venn 图。

1.5 “活性成分-疾病-靶点”网络的构建

准备金钗石斛、霍山石斛活性成分-疾病-靶点相关文件，导入到Cytoscape 3.9.1 软件，利用其绘制活性成分-疾病-靶点作用网络图，计算degree 值，节点大小及颜色深浅按degree 值大小调节，degree 值越大，节点越大，颜色越深。

1.6 关键靶点蛋白相互作用（PPI）网络构建

分别将金钗石斛核心靶点、金钗石斛-疾病与霍山石斛-疾病交集靶点、霍山石斛核心靶点导入到STRING 数据库中进行PPI 网络分析，将物种设置为“Homo Sapien”“minimum required interaction scor”中选择“medium confidence＞0.4”，选择“hide disconnected nodes in the network”，其他默认系统设置，下载TSV 文件。将其导入Cytoscape 3.9.1 软件，在CytoNCA 插件中筛选出degree 值大于平均数的关键靶点，制作PPI 网络图。

1.7 基因本体（GO）功能和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析

分别将金钗石斛核心靶点、金钗石斛-疾病与霍山石斛-疾病交集靶点、霍山石斛核心靶点导入Metascape 进行GO 功能以及KEGG 通路富集分析，GO 富集分析主要包括生物过程（BP）、细胞组分（CC）以及分子功能（MF），筛选GO 功能富集分析前10 项结果制成柱状图进行可视化；筛选KEGG通路富集分析前20 条通路制成气泡图进行可视化。

2 结果

2.1 中药活性成分的查找与筛选

在数据库收集到金钗石斛成分共185 个，霍山石斛成分119 个，将获得（*sdf）的结构导入到SWISS ADME 平台，满足1.1 项下筛选要求后，获得金钗石斛有效活性成分84 个，霍山石斛有效活性成分56 个，见表1、2。

表1 金钗石斛活性成分Table 1 Active components of D. nobile

表2 霍山石斛活性成分Table 2 Active components of D. huoshanense

2.2 中药活性成分靶点的预测

选择SwissTartgetPrediction 平台预测的各活性成分中probability＞0 的靶点，获得金钗石斛有效活性成分预测靶点776 个，霍山石斛有效活性成分预测靶点762 个。

2.3 疾病靶点的收集

GeneCards 数据库中预测的阿尔茨海默病疾病靶点12 814 个，筛选后获得疾病靶点1 312 个；OMIM 中预测阿尔茨海默病疾病靶点278 个，将二者合并、去重后共获得疾病靶点1 474 个。

2.4 药物成分及其预测靶点

将最终获得金钗石斛和霍山石斛有效活性成分的预测靶点分别与疾病靶点做Venn 图，共获得金钗石斛-疾病交集靶点255 个，霍山石斛-疾病靶点243 个；将以上二者做Venn 图，获得共同靶点208 个，在阿尔茨海默病预测靶点中，金钗石斛相对于霍山石斛差异靶点47 个，霍山石斛相对于金钗石斛差异靶点35 个，见图1A～D。

图1 药物成分及其预测靶点Venn 图Fig.1 Venn diagram of drug composition and predicted target

2.5 “活性成分-疾病-靶点”网络图

利用Cytoscape 3.9.1 软件，按degree 值进行调整后最终得到有422 个节点，3 387 条边的“活性成分-疾病-靶点”网络图。网络图中圆形节点（node）代表成分，方形节点代表预测的靶点，边（edge）表示活性成分和作用靶点的相互作用关系。网络图中金钗石斛degree 值排名前10 位的活性成分为JC40、JC5、JC37、JC38、JC45、A6、JC41、JC43、JC21、JC30；霍山石斛degree 值排名前10位的活性成分为HS31、HS28、HS19、HS11、HS47、A6、HS8、HS7、HS44、HS45。以上可能为主要抗阿尔茨海默病主要活性成分，见图2。

图2 药物-活性成分-疾病-靶点图Fig.2 Drug-active ingredient-disease-target graph

2.6 PPI 网络拓扑分析

将金钗石斛-霍山石斛共同靶点导入String 平台，获得节点数208，边数为3 634 的PPI 网络图（P＜0.01）；将金钗石斛差异靶点输入到String 平台，获得节点数47，边数143 的PPI 网络图（P＜0.01）；将霍山石斛差异靶点输入到String 平台，获得节点数35，边数45 的PPI 网络图（P＜0.01），分别获得TSV 文件，将其导入Cytoscape 3.9.1 软件，在CytoNCA 插件中筛选degree 值较高靶点，重新调整网络，获得金钗石斛-霍山石斛共同靶点节点数为65，边数为1 258 的PPI 网络；金钗石斛差异靶点节点数为13，边数为54 的PPI 网络图；霍山石斛差异靶点节点数为8，边数为14 的PPI 网络图，见图3～5。

图3 金钗石斛-霍山石斛共同靶点Fig.3 Common target of D. nobile-D. huoshanense

图4 金钗石斛差异靶点Fig.4 Differential targets of D. nobile

图5 霍山石斛差异靶点Fig.5 Different targets of D. huoshanense

2.7 GO 功能和KEGG 通路富集分析

分别将208 个金钗石斛-霍山石斛共同靶点、47 个金钗石斛差异靶点、35 个霍山石斛差异靶点呈递到Matescape 数据库进行KEGG 通路注释分析和GO 功能分析。按数量值从大到小排列，筛取前20 条KEGG 通路注释分析和GO 功能分析结果，显示金钗石斛-霍山石斛共同靶点中治疗阿尔茨海默病的相关通路有磷脂酰肌醇-3-羟激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信号通路、神经退行性变的途径-多种疾病、阿尔茨海默病、Ras 信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、Rap1 信号通路、钙离子信号通路、cAMP 信号通路、低氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路等；金钗石斛差异靶点中治疗阿尔茨海默病的相关通路有Toll 样受体信号通路、阿尔茨海默病、神经退行性变的途径-多种疾病、细胞衰老等；霍山石斛差异靶点中治疗阿尔茨海默病的相关通路有神经退行性变的途径-多种疾病、阿尔茨海默病、MAPK 信号通路、神经营养因子信号通路、甲状腺激素信号通路、Ras 信号通路以及肿瘤坏死因子（TNF）信号通路等，见图6～8。

图6 金钗石斛-霍山石斛GO 功能富集和KEGG 通路分析Fig.6 Analysis of D. nobile and D. huoshanense common GO function enrichment KEGG pathway analysis

图8 霍山差异靶点GO 功能富集和KEGG 通路分析Fig.8 GO functional enrichment and KEGG pathway analysis of Dendrobium huoshanense differential targets

3 讨论

经筛选，金钗石斛与霍山石斛共同成分共有8个，其中gigantol 结合靶点最多，并有研究表明gigantol 属于石斛中的联苄类化合物，具有较好的抗肿瘤、抗氧化、增强免疫力等作用，能够通过激活PI3K-Akt 显著防止H2O2诱导的细胞凋亡，临床中治疗缺血性疾病有较好疗效[18-19]；其次，金钗石斛的差异成分有N-isopentenyl-6-hydroxyden droxinium、3-O-methylgigantol、moscatilin、crepidatin、nobilin C 等，霍山石斛中还有 erianin、dihydroresveratrol、dendrocandin U、3-hydroxy-5,4'-dimethoxybibenz 等活性成分，均以联苄类和生物碱类成分为主，以上可能为金钗石斛、霍山石斛治疗阿尔茨海默病的主要活性成分。刘敬等[20]研究表明，毛兰素的神经保护作用可能与激活抗凋亡有关，为未来进一步展开神经系统疾病基础及临床研究奠定基础。

金钗石斛-霍山石斛疾病交集靶点中聚ADP核糖聚合酶（PARP1）、细胞色素 P45019A1（CYP19A1）、细胞周期蛋白依赖性激酶5 激活因子1（CDK5R1）、基质金属蛋白酶1（MMP1）、花生四烯酸-5-脂加氧酶（ALOX5）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、雌激素受体2（ESR2）等；金钗石斛差异靶点中法尼醇X 受体（NR1H14）、谷胱甘肽硫转移酶P1（GSTP1）、核受体亚家族3C 组成员2（NR3C2）等；霍山石斛差异靶点中Ⅴ组磷脂酶A2（PLA2G5）、溶质载体家族2 成员1（SLC2A1）、DNA 甲基转移酶1（DNMT1）等。这些靶点可能为金钗石斛与霍山石斛治疗阿尔茨海默病的作用靶点。PPI 网络提示，Akt1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、白蛋白（ALB）、TNF、酪氨酸蛋白激酶（SRC）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、促分裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、表皮生长因子受体（EGFR）、胱天蛋白酶3（CASP3）、信号转导及转录激活蛋白3（STAT3）为金钗石斛-霍山石斛共同作用PPI 网络图中核心靶点；白细胞介素-6（IL-6）、Toll 样受体4（TLR4）、生长调节致癌基因β（CXCLB）等为金钗石斛差异PPI 网络图中核心靶点，连环蛋白 β1（CTNNB1）、热休克蛋白 5（HSPA5）、微管相关蛋白tau（MAPT）等为霍山石斛差异PPI 网络图中核心靶点。研究表明，激活PARP1 减少DNA 损伤，可以在一定程度上改善细胞衰老[21]；雌激素对阿尔茨海默病有一定的神经保护作用，CYP19A1 基因可编码合成雌激素的关键酶，CYP19A1 基因的多态性与阿尔茨海默病相关，人类CYP19A1 rs2899472 基因突变会对Aβ42 和Tau 蛋白水平表达产生影响，能够增加阿尔茨海默病的发病风险[22]。此外，Akt1 能够通过调控Tau 蛋白发挥抗阿尔茨海默病作用；VEGFA 能够有效促进血管生成，在阿尔茨海默病的发生发展尤其是缺血性阿尔茨海默病的过程中发挥着重要作用；MAPK3 参与多种应激诱导的细胞凋亡，提高Tau蛋白的磷酸化；CASP3 可能会引起Tau 蛋白异常磷酸化，从而引起神经元纤维缠结，造成阿尔茨海默病；在Aβ 的持续刺激下小胶质细胞、星形胶质细胞和单核细胞会释放大量致炎因子，包括IL-6、TNF-α 等，从而不断地加重阿尔茨海默病的炎症反应[23-24]。金钗石斛和霍山石斛可能通过作用于以上靶点通过多种方式起到治疗阿尔茨海默病的作用。

GO 功能与KEGG 富集分析结果显示金钗石斛与霍山石斛可能是通过PI3K-Akt 信号通路、神经退行性变的途径-多种疾病、阿尔茨海默病等途径，作用在树突、轴突等位置，主要调节激酶活性蛋白激酶活性、激酶结合、蛋白激酶结合，参与磷、酸化正调控、蛋白磷酸化等BP，发挥治疗阿尔茨海默病的作用。此外，金钗石斛可以通过Toll 样受体信号通路、细胞衰老作用于神经元细胞体，细胞体，树突，轴突等位置治疗阿尔茨海默病，霍山石斛可以通过MAPK 信号通路、神经营养因子信号通路等，作用于轴突、神经突触后等位置，通过调节蛋白激酶活性、激酶结合等，参与蛋白磷酸化调节发挥治疗阿尔茨海默病的作用。研究表明，PI3K-Akt信号通路是神经存活信号转导的主要途径、参与调节大脑认知功能的重要途径，进一步佐证了此项网络药理学结果[25]。

综上所述，金钗石斛和霍山石斛可能会在凋亡、氧化应激反应、血管生成、基因遗传、炎症反应等多个方面，通过PI3K-Akt 信号通路、神经退行性变的途径-多种疾病、阿尔茨海默病等多个通路起到抗阿尔茨海默病作用，充分体现了中药多维度、多靶点治疗阿尔茨海默病的优势。此外，相对于霍山石斛，金钗石斛从细胞衰老、炎症反应方面抗阿尔茨海默病可能有一定优势；而霍山石斛除了相同通路外，还可能作用MAPK 信号通路、神经营养因子信号通路、甲状腺激素信号通路、TNF 信号通路治疗阿尔茨海默病。

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