心力衰竭犬肾交感神经消融术后降钙素基因相关肽的变化

罗仪山　陈璐珊　潘艺朝　李韶南　刘震　陈平安

【摘要】  目的    探讨肾交感神经消融术（RDN）后不同时间肾动脉降钙素基因相关肽（CGRP）的表达情况。方法    采用腹主动脉结扎方法制备犬慢性心力衰竭模型，并行RDN。观察RDN术后不同时间心力衰竭犬血浆及肾动脉CGRP的表达情况。结果    实时荧光定量聚合酶链反应（QT-PCR）显示，与心力衰竭组（HF组）相比，RDN术后3.5个月CGRP表达水平明显降低（P<0.05），RDN术后9个月CGRP表达量高于术后3.5个月但低于心力衰竭（HF）组（P<0.05）。免疫组织化学染色显示RDN术后3.5个月组光密度值低于HF组和RDN术后9个月（P<0.05）。结论    RDN术后随着时间的推移肾动脉中存在CGRP表达水平上调，肾交感神经可能存在一定程度恢复。

【关键词】  心力衰竭； 动物模型； 犬； 交感神经消融术； 降钙素基因相关肽

Variation of calcitonin gene related peptide in dogs with heart failure after renal devervationLuo Yishan，Chen Lushan，Pan Yichao，Li Shaonan，Liu Zhen，Chen Ping'an*. The First People's Hospital of Guangzhou， Guangzhou，Guangdong    510180

【Abstract】  Objective  To investigate the expression of calcitonin gene related peptide in the different periods after renal devervation in dogs with heart failure. Methods    After induced by abdominal aortaconstriction，the dogs were divided into three groups according to whether they underwent renal devervation or the period after renal devervation. Relativegene or protein expression of calcitonin gene related peptide（CGRP）in the renal artery tissues was analyzed by quantitative real time polymerase chain reaction or Western-blot respectively. Plasma levels of CGRP were also detected. Results    Compared with the heart failure group， the expression of CGRP in the RDN 1 group（3.5 months after RDN）was significantly decreased（P<0.05）. The expression of CGRP in the RDN 2 group（9 months after RDN）was higher than that in the RDN 1 group， but still lower than in the heart failure group（P<0.05）.Semi-quantitative analysis of immunohistochemistry staining， indicated asthe values of the average optical density（AOD）measured by Image Pro Plus 6.0， showed that values of AOD was lower in the RDN 1 group than in the RDN 2 and heart failure groups（P<0.05）. Conclusion    The expression of CGRP in the renal artery increased with the extent of time after RDN.

【Key Words】  Heart failure； Animal model； Dogs； RDN； Calcitonin gene related peptide

中圖分类号：R544.1        文献标识码：A        文章编号：1672-1721（2023）25-0008-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.25.003

肾交感神经消融术（renal devervation，RDN）通过阻断肾动脉周围交感神经可起到降低全身交感神经活性的作用。有研究显示，RDN对难治性高血压、心力衰竭等交感神经活性增加性疾病具有一定的疗效[1-3]。然而也有研究显示RDN的降压疗效不确切[4]，推测可能与术者经验，术中消融次数、部位及其释放的能量，特定的亚组人群不同等诸多因素有关。资料显示肾交感神经损伤后可能存在再生[5]，若RDN后存在肾交感神经再生，势必会影响到RDN的疗效。本研究从动物实验的角度探讨RDN后不同时间肾动脉降钙素基因相关肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）的表达情况，通过神经相关肽的变化了解RDN术后肾动脉神经的变化。

1    材料与方法

1.1    实验动物和分组    成年健康杂种雄性犬（普通级）14只，体质量12.42～13.01 kg，平均体质量（12.57±1.70）kg，购自广州龙归兴科动物养殖场。采用腹主动脉结扎方法建立犬慢性心力衰竭（HF）模型后（造模术中及术后共死亡2只）行RDN（术中及术后共死亡3只）。术后分为3组：HF组3只，RDN 1组3只（RDN术后3.5个月），RDN 2组3只（RDN术后9个月）。

1.2    动物心力衰竭模型的制备    采用腹主动脉结扎方法制备犬慢性心力衰竭模型。3%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉成功后在双肾动脉分叉处上段游离腹主动脉，用软管环绕此处腹主动脉一周测出血管周径，用手术缝合线双线结扎腹主动脉，使其周径减少约50%，结扎后手指尖触及结扎处下方腹主动脉壁有血流增速感和冲击感。术后标准饲料喂养[6]。

1.3    RDN    经犬股动脉插入8F指引导管行肾

动脉造影明确肾动脉位置后经股动脉植入消融导管（Biosense Webster Ltd，Israel），腹部放置消融电极片并连接射频消融仪（SmartAblate，Germany），消融温度为45 ℃，功率为4 W。分别对左右两侧肾动脉采用螺旋式消融6个不同位点，每个位点持续1～2 min。HF组行股动脉穿刺并送入造影导管行双侧肾动脉造影后再送入消融导管，不行肾动脉消融术[6]。

1.4    蛋白质印迹法（Western-blot）法测定肾动脉中CGRP蛋白表达    将肾动脉组织裂解后测定蛋白浓度，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜，先后加入第一抗体（上海江莱生物）、第二抗体孵育，化学发光法显色，采用β-actin作为内参，Image J软件进行定量分析。

1.5    实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polywerase chain reaction，QT-PCR）检测肾动脉CGRP的表达    采用Trizol试剂提纯肾动脉组织总RNA，并检测RNA含量和纯度，反转录成互补脱氧核糖核酸（complernentary DNA，cDNA）。按文献方法设计CGRP引物序列，CGRP的信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）相对表达的定量结果依据2-ΔΔCt法计算。

1.6    免疫组织化学染色    取1.5 cm×1.5 cm×0.2 cm新鲜肾动脉组织块放入10%甲醛溶液中固定，制成石蜡切片，进行CGRP免疫组织化学染色。

1.7    酶联免疫吸附测定（enzyme linked immuno- sorbent assay，ELISA）血浆CGRP含量    取标本前采取3组动物股静脉血液2 mL，3 000 r/min离心10 min后分离出血浆-80 ℃低温保存，按照试剂盒说明书采用ELISA法检测血浆CGRP含量（上海江莱生物）。

1.8    统计学方法    使用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，正态分布计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2    结果

2.1    一般情况及RDN    腹主动脉结扎后，犬出现不同程度倦怠、消瘦等情况。后进行RDN，RDN术中及术后共死亡3只HF模型犬，可能与消融温度过高或消融时间过长有关。造影导管行犬肾动脉造影如图1所示，消融导管行犬RDN术如图2所示。

2.2    Western-blot法测定肾动脉中CGRP蛋白表达水平    RDN 2组CGRP蛋白表达较RDN 1组增高，见图3。

2.3    QT-PCR检测肾动脉CGRP-mRNA表达    与HF组相比，RDN 1组、RDN 2组的CGRP-mRNA表达水平均明显降低（P<0.05），但RDN 2组表达水平高于RDN 1组（P<0.05），見表1。

2.4    CGRP阳性染色细胞吸光度（A）值比较    将3组实验动物的肾动脉标本制成石蜡切片后行免疫组织化学，利用Image Pro Plus 6.0软件计算阳性染色细胞的A值并作单因素分析。HF组、RDN 2组的A值均大于RDN 1组（P<0.05），但HF组和RDN 2组比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

2.5    ELISA检测血浆CGRP含量    3组中HF组血浆CGRP含量最高，RDN 1组其次，RDN 2组血浆CGRP含量最低，差异均有统计学意义（P<0.05），见表3。

3    讨论

交感神经在心力衰竭的发生、发展过程中发挥着重要作用。肾交感神经的激活对心力衰竭可产生不利影响[7]，因此，采用RDN降低肾脏交感神经活性，对慢性心力衰竭、高血压等交感神经活性增加性疾病有利。

RDN主要通过降低肾交感神经活性起到影响全身交感神经活性的作用，故RDN后肾交感神经乃至全身交感神经活性降低程度是影响RDN疗效的重要因素。然而有资料显示肾交感神经损伤后可能存在再生，MULDER J等[5]研究表明采用外科手术切除肾交感神经后12周，能观察到肾交感神经的再生。GAZDAR A F等[8]在肾移植患者的肾组织中也观察到神经再生，BOOTH L C等[9]对羊行RDN，术后也观察到羊肾动脉出现了交感神经再支配现象。RDN后肾交感神经的再生势必会影响到RDN的去神经疗效。

相对于外科手术切除肾交感神经，RDN只是对局部肾交感神经起损伤作用，目前尚不知心力衰竭时RDN术后是否存在肾交感神经再生现象。本研究通过动物实验的方法观察了RDN术后不同时间反映神经分布情况或再生的相关肽类CGRP的表达量的变化情况，QT-PCR和Western-blot结果显示，RDN 2组肾动脉CGRP的表达量比RDN 1组增加；免疫组化结果也显示RDN 2组CGRP阳性染色细胞A值高于RDN 1组，低于HF组（P<0.05）。这表明随着RDN时间的延长反映神经再生的CGRP表达出现增加，提示RDN后随着时间的推移肾交感神经可能存在再生。CGRP是一種广泛分布于神经组织的肽类，具有促进神经细胞生长的作用，CGRP水平高低可间接反映神经的生长情况。有研究显示CGRP能够作用于雪旺细胞促进周围神经再生[10]。故心力衰竭时RDN术后CGRP表达增加可能有利于肾动脉周围神经的再生。本研究中RDN 2组血浆CGRP含量低于RDN1组，与Western-blot、适时定量PCR及病理结果有一定差异，这可能与血浆CGRP含量影响因素较多，一些心脑血管疾病对血浆CGRP含量有影响有关[11-12]，也可能与本研究样本量小有关，需大样本研究进一步证实。

综上所述，对心力衰竭犬行RDN术后随着时间的推移肾动脉中反应神经再生的相关肽类物质CGRP表达水平出现上调，提示RDN术后可能存在肾交感神经数量的部分恢复并影响其疗效，这为今后优化RDN的心力衰竭疗效提供了相关实验资料。

参考文献

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（收稿日期：2023-06-07）