基于ROS-NLRP3 炎症小体介导的细胞焦亡探究利拉鲁肽对糖尿病肾病大鼠肾损伤的保护作用

王卓怡，陆筱波

张家港市中医医院 药学部，江苏 张家港 215600

糖尿病肾病是糖尿病患者最为常见的并发症之一，也是介导慢性肾病和终末期肾衰竭的主要原因[1]。流行病学调查显示，全球有30%～40%的糖尿病患者会因为病情的迁延而进展至糖尿病肾病，其中伴有终末期肾脏病患者的5 年生存率＜20%[2]。因此，延缓糖尿病肾病进展对于改善糖尿病患者生存质量具有重大意义。糖尿病肾病发病机制复杂可能与慢性炎症、氧化应激、糖脂代谢紊乱及血流动力学异常相关[3-4]。研究表明，持续性的炎症反应是导致糖尿病肾病病情进展的关键因素[5-6]。细胞焦亡是近年来发现的一种与炎症反应密切相关的新型程序性细胞死亡方式，可由Caspase-1 依赖性经典细胞焦亡途径和Caspase-4/5/11 依赖性非经典细胞焦亡途径触发，导致细胞肿胀及内容物释放，从而诱发炎症级联反应[7]。研究已证实，以Caspase-1 介导经典细胞焦亡途径在糖尿病肾病中被广泛性研究，NOD 样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体、Caspase-1 及其下游靶标分子消皮素D（GSDMD）是介导经典细胞焦亡发生的关键[8]。活性氧簇（ROS）除了是介导氧化应激反应的关键调控因子外，也是NLRP3炎症小体活化的上游启动因子，能够诱导NLRP3 炎症小体活化，促进炎症因子成熟及分泌，从而诱导细胞焦亡[9]。因此，以Caspase-1 介导的细胞焦亡为靶标，通过干预ROS-NLRP3 炎症小体途径将为糖尿病肾病防治提供新的治疗策略和干预靶点。

利拉鲁肽是一种长效的胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体激动剂[10]。研究发现，利拉鲁肽除具有良好的降血糖作用外，还具有抑制氧化应激反应和减轻机体炎症等作用[11-12]。马秀琦等[13]研究发现，利拉鲁肽能够通过抑制NLRP3 炎症小体活化，降低炎症因子释放，改善糖尿病肾病大鼠损伤。但目前有关利拉鲁肽对糖尿病肾病细胞焦亡的作用尚未见相关报道。本研究拟通过构建糖尿病肾病大鼠模型，从ROS-NLRP3 炎症小体途径，阐明利拉鲁肽对糖尿病肾病细胞焦亡的作用，旨在为利拉鲁肽临床治疗糖尿病肾病提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 雄性，SPF 级，SD 大鼠，周龄6 周，体质量（200±10）g，购自于北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK（京）2019-0017]。所有大鼠均放置于清洁级实验动物房内饲养，动物房内温度（25±2）℃，环境相对湿度55%～65%，12 h/12 h昼夜交替光照，适应性喂养1 周。本动物实验符合替代、减少、优化基本原则，且经过本院实验动物伦理委员会审批（批号LLSC2020-10-002）。

1.1.2 主要试剂 利拉鲁肽注射液（诺和诺德公司，批号202106ABV1，规格3 mL∶18 mg/支）；链脲佐菌素（STZ，美国Sigma 公司，批号S1030）；N-乙酰半胱氨酸（NAC，英国Abcam 公司，批号ab143032）；血清肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）检测试剂盒（美国Sigma 公司，批号MAK080、MAK006）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH）（南京建成生物工程研究所，批号A003-1-2、A001-1-3、A005-1-2）；二氢乙锭（DHE）染色液（美国Santa Cruz 公司，批号sc-204724A）；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号G1120）；Masson 染色检测试剂盒（武汉塞维尔生物科技有限公司，批号G1006）；BCA 蛋白质浓度检测试剂盒、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗、ECL 发光液、β-actin一抗（碧云天生物技术，批号P0009、A0208、A0216、P0018S、AF5001）；NLRP3 一抗、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）一抗、Caspase-1 一抗、GSDMD 一抗、白细胞介素（IL）-1β 一抗、IL-18 一抗（美国Cell Signaling Technology，批号15101、67824、83383、39754、12242、57058）。

1.1.3 主要仪器 Cobas c702 全自动生化分析仪（德国Roch 公司）；BX53 光学显微镜（日本Olympus公司）；BX43 荧光显微镜（日本Olympus 公司）；1730R 高速冷冻离心机（上海贝晶生物技术公司）；GelDoc XR+凝胶成像仪（美国Bio-Rad 公司）；Rt2100c 多功能酶标仪（美国Rayto 公司）。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病肾病模型构建、分组及给药 将60 只SD 大鼠适应性喂养1 周，随机分为对照组10 只和模型组50 只。采用多次小剂量 ip STZ 40 mg/kg，连续5 d 构建糖尿病大鼠模型，注射3 d 后连续3 d空腹血糖值均≥16.7 mmol/L，则判定糖尿病大鼠模型构建成功[14]。定期进行血糖检测，剔除血糖缓解者，饲养4 周后检测糖尿病大鼠24 h 尿蛋白水平，若尿蛋白定量≥30 mg，且尿糖为阳性者，则判定糖尿病肾病大鼠模型构建成功[15]。造模过程中，大鼠死亡2 只，造模失败2 只，共计46 只大鼠造模成功。从造模成功大鼠中随机选取40 只分为模型组、利拉鲁肽组、ROS 抑制剂（NAC）组、利拉鲁肽＋NAC 组，每组各10 只。利拉鲁肽组大鼠sc 200 μg/(kg·d)的利拉鲁肽[13]；NAC 组大鼠ip 20 mg/(kg·d)的NAC；利拉鲁肽＋NAC 组大鼠sc 200 μg/(kg·d)的利拉鲁肽的同时ip 20 mg/(kg·d)的NAC；对照组和模型组大鼠sc 等量的生理盐水，1 次/d，连续治疗4 周。治疗4 周后，收集大鼠24 h 尿液、肾组织及血液进行后续实验研究。

1.2.2 生化指标检测 收集各组大鼠24 h 尿液，测定尿微量蛋白排泄率（MAER）；空腹尾静脉采血，血糖仪测定空腹血糖（FBG），检验试剂盒测定Scr、BUN 水平。

1.2.3 肾组织病理形态学观察 取适量肾组织，除去被膜，4%多聚甲醛固定48 h，经脱水、石蜡包埋、切片后，分别进行HE 染色和Masson 染色，通过光学显微镜下观察肾组织病理学变化并采集图像。

1.2.4 肾组织氧化应激指标检测 取出液氮中冻存的肾组织，称取1 g 肾组织采用预冷的生理盐水将其充分碾磨制备成10%的组织匀浆，化学比色法检测肾组织MDA 含量及SOD 和GSH 活性。

1.2.5 肾组织ROS 含量检测 取出固定好的肾组织，常规方式制备成石蜡切片，于避光条件下将组织切片置于DHE（10 μmol/L）溶液中孵育20 min，PBS 溶液清洗切片3 次，荧光显微镜下观察各组大鼠肾组织细胞红色荧光情况，并通过Image Pro Plus 6.0 软件进行ROS 荧光强度半定量检测。

1.2.6 Western blotting 检测肾组织NLRP3 炎症小体和焦亡相关蛋白表达 取适量的肾组织加入蛋白裂解液进行组织匀浆，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，吸取上清液即为总蛋白，BCA 法测定蛋白质浓度，蛋白质变性后进行凝胶电泳，每个泳道上样蛋白为30 μg，SDS-PAGE 凝胶电泳后，行湿转转膜只PVDF 膜上，5%脱脂牛奶封闭60 min，TBST洗膜，加入一抗NLRP3（1∶1 000）、ASC（1∶500）、Caspase-1（1∶500）、GSDMD（1∶1000）、IL-1β（1∶500）、IL-18（1∶500）、β-actin（1∶5 000），4℃，孵育过夜；TBST 洗膜，加入山羊抗兔或山羊抗鼠二抗（1∶5 000），室温下，孵育60 min，TBST 洗膜，滴加显影液对目的蛋白进行可视化处理，并采用Image Pro Plus 6.0 软件进行蛋白质条带灰度值半定量分析。

1.3 统计学分析

Graphpad prism 6.0 软件进行统计学数据处理。数据以表示，数据满足正态分布且方差齐性，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。

2 结果

2.1 利拉鲁肽对糖尿病肾病大鼠空腹血糖及肾功能生化指标的影响

与对照组大鼠相比，模型组大鼠FBG、24 h 尿液MAER、血清Scr、BUN 水平均显著升高（P＜0.05）。与模型组相比，利拉鲁肽组和NAC 组大鼠的24 h 尿液MAER、血清Scr、BUN 水平均显著降低（P＜0.05）。与利拉鲁肽组相比，利拉鲁肽＋NAC组大鼠的24 h 尿液MAER、血清Scr、BUN 水平均显著降低（P＜0.05），而FBG 水平无显著性变化，见表1。

表1 各组大鼠空腹血糖及肾功能生化指标比较（，n=10）Table 1 Comparison of FBG and biochemical indicators of renal function in each group of rats (,n=10)

表1 各组大鼠空腹血糖及肾功能生化指标比较（，n=10）Table 1 Comparison of FBG and biochemical indicators of renal function in each group of rats (,n=10)

与对照组比较：*P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05；与利拉鲁肽组比较：&P＜0.05*P ＜ 0.05 vs control group;#P ＜ 0.05 vs model group;&P ＜ 0.05 vs liraglutide group

2.2 利拉鲁肽对糖尿病肾病大鼠肾组织病理形态学的影响

对照组大鼠肾组织肾小球无明显的肥大增生等病理改变。与对照组相比，模型组大鼠肾组织肾小球肥大、增生、肾小管基底膜增厚及系膜基质增多明显。与模型组相比，利拉鲁肽组、NAC 组、利拉鲁肽＋NAC 组大鼠肾组织肾小球肥大、增生，系膜扩张和系膜基质增多等病理改变均得到明显改善。与利拉鲁肽组相比，利拉鲁肽＋NAC 组大鼠肾组织形态和结构病理改变更为显著，见图1。

图1 各组大鼠肾组织形态和结构变化（×400）Fig.1 Changes of renal tissue morphology and structure of rats in each group (× 400)

2.3 利拉鲁肽对糖尿病肾病大鼠肾组织氧化应激水平的影响

与对照组相比，模型组大鼠肾组织MDA 含量显著升高，SOD、GSH 含量均显著降低（P＜0.05）。与模型组大鼠相比，利拉鲁肽组和NAC 组大鼠肾组织MDA 均含量显著降低，SOD、GSH 含量均显著升高（P＜0.05）。与利拉鲁肽组大鼠相比，利拉鲁肽＋NAC 组大鼠的肾组织MDA 含量均显著降低，而SOD、GSH 含量均显著升高（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠肾组织氧化应激水平比较（，n=10）Table 2 Comparison of oxidative stress levels in renal tissue of rats in each group (,n=10)

表2 各组大鼠肾组织氧化应激水平比较（，n=10）Table 2 Comparison of oxidative stress levels in renal tissue of rats in each group (,n=10)

与对照组比较：*P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05；与利拉鲁肽组比较：&P＜0.05*P ＜ 0.05 vs control group;#P ＜ 0.05 vs model group;&P ＜ 0.05 vs liraglutide group

2.4 利拉鲁肽对糖尿病肾病大鼠肾组织ROS 和NLRP3 炎症小体活化的影响

与对照组相比，模型组大鼠肾组织ROS 水平、NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表达显著升高（P＜0.05）。与模型组相比，利拉鲁肽组和NAC 组大鼠肾组织ROS 水平、NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表达均显著降低（P＜0.05）。与利拉鲁肽组相比，利拉鲁肽＋NAC 组大鼠肾组织ROS 水平、NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表达均显著降低（P＜0.05），见图2、表3。

图2 各组大鼠肾组ROS 染色（A）及NLRP3 炎症小体相关蛋白电泳图（B）Fig.2 ROS staining (A) and NLRP3 inflammasome associated protein electrophoresis (B) of rat kidney groups in each group

表3 各组大鼠肾组织ROS 水平及NLRP3 炎症小体相关蛋白相对表达（，n=10）Table 3 ROS levels and NLRP3 inflammasome related protein expression in renal tissue of rats in each group (,n=10)

表3 各组大鼠肾组织ROS 水平及NLRP3 炎症小体相关蛋白相对表达（，n=10）Table 3 ROS levels and NLRP3 inflammasome related protein expression in renal tissue of rats in each group (,n=10)

与对照组比较：*P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05；与利拉鲁肽组比较：&P＜0.05*P ＜ 0.05 vs control group;#P ＜ 0.05 vs model group;&P ＜ 0.05 vs liraglutide group

2.5 利拉鲁肽对糖尿病肾病大鼠肾组焦亡相关蛋白表达的影响

与对照组相比，模型组大鼠肾组织焦亡相关蛋白 cleaved-Caspase-1/pro-Caspase-1、GSDMDN/GSDMD、IL-1β、IL-18 蛋白表达显著升高（P＜0.05）。与模型组相比，利拉鲁肽组和NAC 组大鼠肾组织焦亡相关蛋白 cleaved-Caspase-1/pro-Caspase-1、GSDMD-N/GSDMD、IL-1β、IL-18 蛋白表达均显著降低（P＜0.05、0.01）。与利拉鲁肽组相比，利拉鲁肽＋NAC 组大鼠肾组织焦亡相关蛋白cleaved-Caspase-1/pro-Caspase-1、GSDMD-N/GSDMD、IL-1β、IL-18 蛋白表达均显著降低（P＜0.05、0.01），见图3、表4。

图3 各组大鼠肾组织焦亡相关蛋白电泳图Fig.3 Electrophoretic maps of pyroptosis related proteins in renal tissue of rats in each group

表4 各组大鼠肾组织焦亡相关蛋白相对表达（，n=10）Table 4 Relative expression of pyroptosis related proteins in renal tissue of rats in each group (,n=10)

表4 各组大鼠肾组织焦亡相关蛋白相对表达（，n=10）Table 4 Relative expression of pyroptosis related proteins in renal tissue of rats in each group (,n=10)

与对照组比较：*P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01；与利拉鲁肽组比较：&P＜0.05 &&P＜0.01*P ＜ 0.05 vs control group;#P ＜ 0.05 ##P ＜ 0.01 vs model group;&P ＜ 0.05 &&P ＜ 0.01 vs liraglutide group

3 讨论

糖尿病肾病是糖尿病患者发病和死亡的主要原因之一，在1 型和2 型糖尿病患者中的发病率高达30%和50%，严重危害糖尿病患者生命健康[16]。目前尚无治疗糖尿病肾病的特异性药物，临床现有的治疗方式尚不能得到满意的效果，大约有50%的糖尿病肾病患者需要肾脏替代治疗[3]。1 项荟萃分析显示，GLP-1 受体激动剂能够明显改善2 型糖尿病的肾脏结局[17]。研究表明，利拉鲁肽作为长效GLP-1 受体激动剂能够通过降低血糖、抑制氧化应激和炎症反应等途径改善糖尿病肾病肾损伤[11-12]。但是，目前有关利拉鲁肽对2 型糖尿病肾病肾损伤的保护作用机制尚不完全清楚。本研究通过多次小剂量ip STZ 构建糖尿病肾病大鼠模型，观察利拉鲁肽对糖尿病肾病大鼠肾损伤的保护作用。结果显示，造模4 周后，大鼠肾功能指标24 h MAER、Scr、BUN 水平均显著升高，肾组织形态结构出现明显的病理损伤，表明糖尿病肾病大鼠模型构建成功。与模型组相比，利拉鲁肽能够通过降低肾功能指标、血糖水平，改善糖尿病肾病肾损伤。

炎症反应作为糖尿病肾病进展的重要病理机制，在糖尿病肾病肾功能损伤中发挥关键作用。多项研究表明，通过抑制炎症反应过程中的炎症因子、信号通路及其下游产物能够明显改善糖尿病肾病肾损伤[18-20]。细胞焦亡是新近发现的一种促炎性程序性细胞死亡方式，主要由NLRP3 炎症小体、Caspase-1 和GSDMD 共同介导[21]。研究发现，当细胞受到病原相关分子模式和损伤相关分子模式分子刺激后，诱导炎性Caspase-1 活化，导致细胞焦亡执行者GSDMD 发生剪切形成具有GSDMD-C和细胞毒性GSDMD-N，后者募集至细胞上形成细胞焦亡小孔，促进成熟IL-1β 和IL-18 释放至细胞外，诱导炎症级联反应[22]。研究证实，适度的炎症反应能够对机体产生保护性免疫作用，过度的炎症如炎症风暴、级联反应会导致机体免疫功能的破坏进而加重糖尿病肾病肾损伤[23]。多项研究发现，在糖尿病肾病大鼠模型中肾组织焦亡相关蛋白表达均显著升高，而抑制Caspase-1 表达能够降低高糖诱导的肾小管上皮细胞和足细胞焦亡，改善糖尿病肾病肾损伤[24-25]。以上研究表明，以炎症反应为特点的细胞焦亡可能是糖尿病肾病新型的治疗策略和靶点。本研究结果显示，利拉鲁肽能够降低细胞焦亡相关蛋白表达，改善糖尿病肾病肾损伤。NLRP3 炎症小体是由NLRP3、ASC 和pro-Caspase-1 三者共同组成的蛋白复合物，是启动细胞焦亡的上游反应原件。当机体在多种治病因素的作用下，激活NLRP3 炎症小体，从而诱导Caspase-1 依赖性细胞焦亡[26]。ROS 是介导氧化应激和炎症反应的重要调控因子，ROS 能够通过激活NLRP3 炎症小体，诱导Caspase-1 介导的细胞焦亡[27]。本研究结果显示，利拉鲁肽能够降低ROS 水平，抑制氧化应激和NLRP3 炎症小体活化，提示利拉鲁肽抑制糖尿病肾病细胞焦亡可能与调控ROS-NLRP3 炎症小体途径相关。Shen 等[28]研究发现，石榴皮鞣素能够通过抑制ROS/NLRP3 途径，减轻脂多糖/ATP 诱导的小鼠J774A.1 细胞焦亡，ROS 清除剂NAC 能够发挥与石榴皮鞣素同向作用抑制脂多糖/ATP 诱导的小鼠J774A.1 细胞焦亡。为进一步明确ROS/NLRP3 炎症小体途径在利拉鲁肽抑制糖尿病肾病细胞焦亡中的作用，本实验通过大鼠ip NAC 观察糖尿病肾病大鼠细胞焦亡情况。结果显示，NAC 能够通过抑制ROS/NLRP3 炎症小体介导的细胞焦亡，进而发挥与利拉鲁肽同向糖尿病肾病肾损伤保护作用。与利拉鲁肽组相比，利拉鲁肽＋NAC 组大鼠上述相关指标减轻各更为显著，糖尿病肾病肾损伤得到进一步改善，表明利拉鲁肽能够通过ROS-NLRP3 炎症小体途径，抑制细胞焦亡，进而改善糖尿病肾病大鼠肾损伤。

综上所述，本利拉鲁肽能够通过ROS-NLRP3炎症小体途径，抑制肾组织氧化应激介导的NLRP3炎症小体活化，从而抑制细胞焦亡，并最终发挥抗糖尿病肾病肾损伤作用。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突