网络药理学联合分子对接探索五灵胶囊治疗慢性乙型肝炎的机制

高冉冉，李雯莉，王莹，曹阳*

1.新疆医科大学第一附属医院 急救·创伤中心，新疆 乌鲁木齐 830011

2.新疆医科大学第一附属医院 医务部医务管理科，新疆 乌鲁木齐 830011

慢性乙型肝炎表现为乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阳性，高发病于中国和东南亚等地区[1]。慢性乙型肝炎的病程发展包括纤维化进展、肝硬化形成和肝细胞癌（HCC）发展等严重危害[2]。乙型肝炎病毒（HBV）可与宿主免疫相互作用，产生持续存在和再激活[3]。尽管目前的直接抗病毒疗法在控制HBV 复制和肝硬化方面有一定疗效，但停药后复发率高，需要终身给药[4]。此外，治疗性疫苗接种治疗和免疫治疗也常用于HBV 感染群体的治疗[5-6]。传统中药及其复方有作用靶点多和不良反应少的特点，可能在联合治疗慢性乙型肝炎中有明显的优势，常见的联合治疗慢性乙型肝炎的中药复方有扶正化瘀汤、安络化纤丸和五灵胶囊等[7-8]。五灵胶囊由柴胡、灵芝、丹参、五味子4 味中药组成，可以修复受损肝细胞[9]。HPLC 指纹图谱分析显示五灵胶囊中主要成分有丹酚酸B、柴胡皂苷A、五味子醇甲、五味子甲素、丹参酮ⅡA、五味子乙素等[10]。五灵胶囊自上市以来广泛用于慢性乙型肝炎的治疗，联合抗病毒药物可以降低患者血清肝纤维化指标和肝生化指标[11-12]。然而五灵胶囊治疗慢性乙型肝炎的机制尚未完善，需要进一步研究和探索。本研究采用网络药理学结合分子对接技术通过数据库的汇总和收集揭示五灵胶囊治疗慢性乙型肝炎的主要活性成分、靶标和机制，为临床五灵胶囊的应用和慢性乙型肝炎的治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 五灵胶囊的活性成分和靶点筛选

采用 TCMSP（http://tcmspw.com/）、ETCM（http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/）和BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org.cn/batmantcm/）数据库筛选五灵胶囊成分和靶点。以口服生物度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18 作为五灵胶囊中活性成分的筛选标准。随后采用Uniprot（https://www.uniprot.org/）对五灵胶囊相关靶点进行标准化，合并3 个数据库获得五灵胶囊的活性成分和侯选靶点。

1.2 慢性乙型肝炎疾病靶点的收集

慢性乙型肝炎疾病靶点采用GeneCards（https://www.genecards.org/）、NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、DisGeNET（https://www.Dis genet.org/）数据库分别搜索“chronic hepatitis B”关键词获得。

1.3 五灵胶囊治疗慢性乙型肝炎核心靶点筛选

将五灵胶囊的活性成分靶点与3 个数据库得到慢性乙型肝炎的靶点共同取交集，得到五灵胶囊治疗慢性乙型肝炎的潜在靶点，即共同靶点。随后将交集靶点上传至STRING 数据库（https://cn.stringdb.org/）构建蛋白相互作用网络图（PPI）。采用Cytoscape 软件绘制交集靶标网络图以及五灵胶囊活性成分与交集靶点的网路图，综合2 个网络图得到五灵胶囊治疗慢性乙型肝炎的活性成分和核心靶标。

1.4 基因本体（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析

采用Oebiotech 平台（https://cloud.oebiotech.cn/task/）进行GO 和KEGG 富集，获得相关生物过程（BP）、细胞成分（CC）、分子功能（MF）和相关通路。筛选P＜0.05 的GO 和KEGG 条目绘制条形图和气泡图。

1.5 分子对接分析

为了验证活性成分与对应靶标的结合强弱，采用MOE 软件对上述筛选得到的五灵胶囊活性成分和核心靶标进行分子对接。分别从PubChem 和PDB数据库获得成分和靶标的3D 结构。将核心靶标删除水分子和进行质子化后，分别与对应的活性成分进行对接，获得结合能以及对接的2D 和3D 结构。

2 结果

2.1 五灵胶囊活性成分和靶点

筛选后得到五灵胶囊成分107 种和靶标398个。来源于柴胡的活性成分有13 种，灵芝活性成分有26 种，丹参活性成分有59 种，五味子活性成分有7 种。另外黄芩苷（baicalin）、长管贝壳杉素A（longikaurin A）为共有成分。

2.2 五灵胶囊治疗慢性乙型肝炎核心靶点

从GeneCard、NCBI、DisGeNET 数据库分别获得慢性乙型肝炎靶标10 911、278、415 个，3 个数据库与五灵胶囊389 个靶标取交集，绘制韦恩图，见图1。其中五灵胶囊与3 个数据库共有靶标有29个，包括雌激素受体（ESR1）、过氧化物酶体增殖激活受体（PPARG）、人丝裂原激活蛋白激酶14（MAPK14）、一氧化氮合酶（NOS2）等。

图1 五灵胶囊与慢性乙型肝炎交集靶点韦恩图Fig.1 Venn diagram of intersection target between Wuling Capsules and chronic hepatitis B

2.3 核心靶点PPI 网络图

构建五灵胶囊治疗慢性乙型肝炎的29 个靶标的PPI 网络图，见图2。在PPI 图中越靠近中心的靶标与其他靶标相关性越强，可能在五灵胶囊治疗慢性乙型肝炎中越关键。核心靶标网络图中采用degree 值进行排序，degree 值越高则在五灵胶囊治疗慢性乙型肝炎中可能越重要。最终得到五灵胶囊治疗慢性乙型肝炎的交集靶标有抑癌基因TP53（degree＝26）、白细胞介素-6（IL-6，degree＝26）、肿瘤坏死因子（TNF，degree＝26）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG，degree＝25）等。

图2 29 个交集靶点PPI 网络图Fig.2 PPI network graph of 29 intersection targets

2.4 五灵胶囊治疗慢性乙型肝炎的成分–靶点网络图

依据五灵胶囊治疗慢性乙型肝炎的29 个靶标，从五灵胶囊107 种活性成分中筛选与29 个靶标相对应的成分为五灵胶囊治疗慢性乙型肝炎的活性成分，共得到44 种活性成分，见表1。采用Cytoscape构建44 种五灵胶囊活性成分和29 个慢性乙型肝炎交集靶标的网络图。如图3 所示，采用成分和靶标的degree 值进行排序，得到五灵胶囊治疗慢性乙型肝炎的主要活性成分有来源于柴胡的槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、异鼠李素（isorhamnetin）；来源于灵芝的灵芝酸Z（ganodermic acid Z）、灵芝醇F（ganoderiol F）；来源于五味子的戈米辛R（gomisin R）；来源于丹参的二氢丹参酮内酯（dihydro tanshinlactone）、木犀草素（luteolin）和丹参酮ⅡA（tanshinone ⅡA）等。相关成分较多的靶标主要有ESR1（degree＝33）、PPARG（degree＝13）、NOS2（degree＝11）、维生素D 受体（VDR，degree＝8）、TNF（degree＝7）等。

表1 五灵胶囊治疗慢性乙型肝炎的44 种活性成分Table 1 44 Active ingredients of Wuling Capsules in treatment of chronic hepatitis B

图3 44 种五灵胶囊活性成分与29 个交集靶点网络图Fig.3 Network diagram of 44 active ingredients of Wuling Capsules and 29 intersection targets

2.5 GO 和KEGG 富集结果

将29 个五灵胶囊治疗慢性乙型肝炎的核心靶点进行GO、KEGG 富集分析，结果见图4、5。五灵胶囊发挥抗慢性乙型肝炎功效主要通过调控生物黏附（biological adhesion）、生物调节（biological regulation）和细胞杀伤（cell killings）等BP；抗氧化活性（antioxidant activity）、催化活性（catalytic activity）和酶调节剂活性（enzyme regulator activity）等MF；以及细胞连接（cell junction）、细胞部分（cell part）和细胞外基质（extracellular matrix）等CC。五灵胶囊治疗慢性乙型肝炎的靶标主要富集于IL-17 信号通路（IL-17 signaling pathway）和Th17 细胞分化（Th17 cell differentiation）和TNF 信号通路（TNF signaling pathway）等。其中在IL-17 信号通路中，κ 轻肽基因增强子核因子抑制因子 α（NFKBIA）、MAPK14 可以激活炎症因子IL-6、TNFα、趋化因子2（CCL2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）等。

图4 GO 富集条形图Fig.4 GO enrichment bar graph

图5 KEGG 富集气泡图Fig.5 KEGG enriched bubble diagram

2.6 五灵胶囊活性成分与核心靶点分子对接结果

将ESR1、白细胞介素-1β（IL-1β）、MMP-9、NFKBIA、NOS2、PPARG、TP53、TNF 与成分靶标网络图中对应的成分进行分子对接。如图6 所示，共得到26 组对接，采用热图展示各组对接的结合能，结合能小于-5 kcal/mol（1 cal＝4.4 J）均表示成分和靶标容易结合。如图7 所示，五灵胶囊活性成分与核心靶标间结合力较强。

图6 分子对接热图Fig.6 Molecular docking heat map

图7 分子对接图Fig.7 Molecular docking diagrams

3 讨论

网络药理学分析表明，五灵胶囊中有44 种活性成分作用于29 个治疗慢性乙型肝炎的核心靶点，其中主要成分包括异鼠李素、山柰酚、槲皮素、黄芩苷、灵芝酸R、灵芝醇F、丹参酮ⅡA、异丹参酮Ⅱ、木犀草素、戈米辛R、隐丹参酮等。有研究通过分析五灵胶囊的药效作用成分发现五味子甲素（schisandrin A）、五味子乙素（schisandrin B）、隐丹参酮（crytotanshinone）和丹参酮ⅡA是可以阻止肝细胞免受D-氨基半乳糖诱导的损伤[13]，改善肝功能指标[14]。五灵胶囊治疗慢性乙型肝炎的成分-靶标网络图显示，隐丹参酮主要调控TNF 和STAT3 靶标，丹参酮ⅡA作用于MMP-9、NFKBIA、TP53，表明五灵胶囊的主要药效成分有丹参酮ⅡA、隐丹参酮、五味子乙素、灵芝酸R 和黄芩苷等。

目前，五灵胶囊及其活性成分治疗慢性乙型肝炎已有相关的研究报道。五味子丙素（schisandrin C）可以激活鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cGAS）-干扰素基因刺激因子（STING）通路降低HBV 小鼠模型中乙肝病毒e、c、s 抗原（HBeAg、HBcAg、HBsAg）和HBV-DNA 水平[15]。黄芩苷的苷元成分黄芩素能显著调控HBV 野生型细胞株HepG2.2.15 的HBsAg和HBeAg，且黄芩苷和恩替卡韦联合治疗对抗病毒治疗（核苷类似物NAs）耐药HBVrtM204V/rtLl80M转染的肝癌HepG2 细胞有更显著的作用[16]。山柰酚和槲皮素处理可以降低TNF-α 刺激的L02 正常肝细胞中活化的半胱氨酸蛋白酶3（cleaved caspase-3）蛋白水平，增加磷酸化-细胞外调节蛋白激酶1/2（p-ERK1/2）、磷脂酰肌醇三羟基激酶（PI3K）和B细胞淋巴瘤-xL（Bcl-xL）蛋白的表达；抑制LX2 肝星形细胞的增殖，上调促凋亡因子Bax 和cleaved caspase-8 蛋白水平，从而改善慢性乙型肝炎引起的肝纤维化[17]。木犀草素的衍生物木犀草素-7-O-葡萄糖苷对HBsAg 的抑制率高达77.4%，可以减弱HBV诱导的细胞内活性氧积累和线粒体损伤[18]。此外，龙柴方具有明显的抗HBV 活性且抑制病毒复制，与其主要活性成分异鼠李素等有关[19]。临床研究同样发现五灵胶囊联合替诺福韦酯治疗慢性乙型肝炎有效率提高，肝纤维化指标改善，HBeAg 和HBVDNA 转阴率明显提高[20]。本研究通过网络药理学分析发现五灵胶囊治疗慢性乙型肝炎的主要活性成分为异鼠李素、山柰酚、槲皮素、黄芩苷、灵芝酸R、灵芝醇F、丹参酮ⅡA、异丹参酮Ⅱ、木犀草素和戈米辛R，核心靶点为ESR1、IL-1β、MMP-9、NFKBIA、NOS2、PPARG、TP53 和TNF。表明五灵胶囊活性成分可以抑制HBV 复制，参与增殖、氧化和炎症功能发挥治疗慢性乙型肝炎功效。

五灵胶囊可以通过改善炎症因子、胶原和基质金属蛋白等缓解慢性乙型肝炎及肝纤维化。研究发现，五灵胶囊可以明显改善四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化，具体表现为血清炎症因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 含量降低，而且肝脏组织中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）阳性率降低，胶原蛋白及NF-κB 表达下调[21]。五灵胶囊还能改善脂多糖诱导的大鼠原代枯否细胞中的炎症因子MCP-1、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、NOS 水平，并能够抑制NF-κB 通路蛋白（TNFRⅠ、NF-κBs 亚蛋白、IκKβ、IκB）以及ERK通路的活化[22-23]。此外，五灵胶囊具有降解基质金属蛋白（MMP-3、MMP-9、MMP-13）及其抑制因子（TIMPs）发挥缓解大鼠慢性肝损伤和抗肝纤维化的功效[24]。本研究同样发现五灵胶囊治疗慢性乙型肝炎与炎症因子IL-1β、IL-6、TNF、NOS2、MMP-9、NFKBIA 等靶标的调控有关。

综上所述，五灵胶囊通过异鼠李素、山柰酚、槲皮素等活性成分调控ESR1、IL-1β、MMP-9 等核心靶点治疗慢性乙型肝炎。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突