合并慢性子宫内膜炎的反复着床失败患者CD56+CD16+自然杀伤细胞水平的研究

黎 俏, 余建华, 薛永杰, 陈海霞, 赖放颖,全 燕, 何韶坚, 翁光明, 高天旸

(1. 南方医科大学第二临床医学院, 广东 广州, 510515; 东莞康华医院, 2. 生殖医学科, 3. 血液中心实验室,4. 病理科, 广东 东莞, 523080; 5. 广东省第二人民医院 生殖医学中心, 广东 广州, 510310)

在体外受精-胚胎移植(IVF-ET)/卵胞浆内单精子注射(ICSI)周期中,胚胎着床率约30%[1]。反复着床失败(RIF)的发生率可达5%～10%[2]。近年来关于慢性子宫内膜炎(CE)或免疫因素密切影响RIF预后的相关研究越来越多[3]。CD138检测的CE患病率在RIF患者中为7.7%～44.0%[4]。CE持续炎症将影响患者子宫内膜容受性,从而造成RIF、复发性流产(RM)等不良妊娠结局[5-6]。有研究[7]推测CE引起RIF的机制之一是病原微生物的入侵可能影响宫腔定植微生物,使子宫自然杀伤(uNK)细胞激活及T细胞亚群分化异常等,影响子宫的免疫环境,使子宫内膜容受性下降,导致胚胎植入失败、胎盘形成不良。

人类子宫在生理状态下含有大量的免疫细胞,特别是自然杀伤(NK)细胞[8]。uNK细胞与外周血自然杀伤(PbNK)细胞在活性、表型、功能和形态方面完全不同[9-10]。相较于PbNK细胞, uNK细胞是一种具有高度免疫调节性的NK细胞,可分泌细胞因子以促进血管新生和组织重构[11]。目前,大多数研究都采用CD56+CD16-uNK分型来鉴定uNK细胞,较少提及CD56+CD16+uNK细胞的功能。本研究分析了东莞康华医院生殖中心RIF患者资料,探索RIF合并CE与uNK细胞的关系,评估合并CE的RIF患者外周血和子宫内膜的免疫状态,现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年10月—2023年2月就诊于生殖医学中心的年龄<40岁的82例患者为RIF组,均接受过IVF-ET移植3次及以上或移植高评分卵裂期胚胎数4～6个或高评分囊胚数3个及以上,但均未获得临床妊娠者[2]。另选择同期在本中心行IVF-ET助孕的年龄<40岁的有IVF助孕妊娠活产史且拟再次助孕的82例患者为对照组。

纳入标准: ① 年龄<40岁者; ② 因盆腔输卵管因素行IVF助孕治疗者; ③月经周期正常且规律者(26～31 d); ④ 夫妻双方染色体正常者; ⑤ 生殖解剖结构正常者; ⑥ 内分泌正常者; ⑦ 无自身免疫性疾病者; ⑧ 无高凝血倾向者; ⑨ 无全身感染症状者; ⑩ 男方精液检查正常者。

排除标准: ① 体质量指数(BMI)<18 kg/m2或>28 kg/m2者; ② 染色体异常者; ③ 生殖器官畸形者; ④ 输卵管积液者,子宫内膜异位症或腺肌症者; ⑤ 内分泌指标异常者(合并糖尿病或高血压或代谢性疾病); ⑥ 系统性红斑狼疮者(LA抗体阳性); ⑦ 自身抗体阳性者(抗核抗体、甲状腺抗体、类风湿因子等); ⑧ 卵巢储备功能减退者; ⑨ 子宫内膜不典型增生者; ⑩ 丈夫精液异常者。本研究开展前已获得东莞康华医院伦理委员会批准,所有患者均已告知实验内容并签署知情同意书。

1.2 实验方法

1.2.1 主要仪器: 贝克曼库尔特Navios型流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2.2 标本采集: 采用促黄体生成素(LH)测定试纸,于尿LH峰值出现后,在阴道B超监测排卵后第7～9天,采用子宫内膜取样器吸取2份少量子宫内膜组织,一份采用流式细胞仪检测子宫内膜CD56+CD16+uNK细胞水平; 另一份采用免疫组化方法检测CD138。CD138阳性作为诊断CE的依据。

1.2.3 外周血: 所有受试者近3个月未服用任何甾体激素类药物,于月经来潮第2～5天空腹采集肘部静脉血液3～4 mL, 送检验科检测促卵泡激素(FSH)、LH、雌二醇(E2)、孕酮(P)等水平; 超声监测排卵后第7～9天的黄体中期,采用EDTA-K3采血管采集空腹肘静脉血液3～4 mL, 并检测PbNK细胞、血常规。

1.2.4 子宫内膜组织: 超声监测排卵后第7～9天,采用一次性内膜取样器取少量内膜,置于添加生理盐水的无菌容器中保存。

1.2.5 流式细胞术检测子宫内膜及外周血CD56+CD16+NK细胞表型的绝对计数方法: 采取流式细胞仪结合血细胞分析仪双平台绝对计数方法,首先通过流式细胞仪检测荧光抗体标记呈阳性细胞百分比,然后利用血细胞分析仪获得总细胞的绝对计数值,两者乘积得到所检测样本中荧光标记呈阳性细胞的绝对计数值。

1.2.6 免疫组化结果的判定及CE的诊断: CD138在子宫内膜分泌期表达,主要表达于子宫内膜的腺上皮细胞、间质细胞和腔上皮细胞,呈深棕色染色,腺上皮细胞比间质细胞和腔上皮染色更强,见图1。CE的诊断标准参考文献[12]。免疫组化染色后CD138在浆细胞膜为强阳性,胞质为弱阳性。每高倍镜视野下,子宫内膜间质中见到5个或以上典型的浆细胞,则诊断为CE; 见到5个以下典型的浆细胞,诊断为非CE。制片全过程均由有资质的技术员按照操作规范完成,病理诊断由具有独立发放报告的诊断医生共同完成阅片以及复核,每张片子均需要2位及以上病理科副主任医师复核。

1.3 CE的治疗及妊娠结局的追踪

1.3.1 CE的治疗及治疗后复查: ① 对于确诊的CE患者,全身性使用抗生素是目前公认的治疗方法,口服抗生素为主要给药方式。本研究CE阳性患者采用口服盐酸多西环素片(100 mg, 2次/d, 用药14 d)联合甲硝唑片(400 mg, 2次/d, 用药14 d)治疗[13]。② 治疗结束后下次月经周期黄体期时,采用子宫内膜取样器吸取少量子宫腔内膜组织,采用免疫组化进行CE病理诊断。

1.3.2 CE患者的移植周期及内膜准备方法: CE患者完成1个疗程抗炎治疗且再次复查后,于月经第2～3天B超及性激素[LH、E2、P、人绒毛膜促性腺激素(HCG)]结果达基础状态后,采用激素替代治疗(HRT)方案。口服戊酸雌二醇片(补佳乐, 1 mg/片, 拜耳医药制药)12 d(4～6 mg/d)后,超声监测内膜厚度和雌二醇、LH、P水平,若内膜≥8 mm时,给予黄体酮(黄体酮注射液, 20 mg/支,浙江仙琚制药)60 mg/d肌内注射及地屈孕酮片(达芙通, 10 mg/片,荷兰苏威制药)40 mg/d口服; 于黄体支持转化内膜后行D3或D5胚胎移植,移植后继续给予黄体支持: 黄体酮阴道缓释凝胶(雪诺酮, 90 mg/支,默克雪诺兰制药)90 mg/d阴道给药及地屈孕酮片(达芙通, 10 mg/片,荷兰苏威制药)40 mg/d口服。

1.3.3 妊娠标准与观察指标: 胚胎移植后10 d检测血HCG水平,阳性者2周后超声检查见孕囊确诊为临床妊娠。观察不同分组患者的临床妊娠结局。临床妊娠率=临床妊娠周期/总移植周期×100%; 着床率=胚胎着床数/总移植胚胎数×100%; 早期流产率=孕12周内自然流产周期数/临床妊娠周期数×100%。

A: 放大400倍表现; B: 放大200倍表现; C: 放大100倍表现。深棕色染色为阳性反应。图1 显微镜下不同放大倍数免疫组化检测CD138的表达与定位(SP法)

1.4 统计学分析

采用SPSS 25.0软件进行统计分析。定量数据描述为均值±标准差, RIF组和对照组的参数数据分析采用t检验。RIF组合并CE、RIF组无合并CE、对照组合并CE、对照组无合并CE的黄体中期内CD56+CD16+uNK、CD56+CD16+PbNK细胞水平比例的分析采用卡方检验,组间CE治疗后临床妊娠率、早期流产率的分析采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。采用Pearson相关系数确定uNK与PbNK的相关程度,采用简单线性回归进行线性拟合。

2 结 果

2.1 RIF组与对照组的一般资料比较

2组年龄、不孕年限、基础卵泡数、基础性激素水平比较,差异无统计学意义(P>0.05), 见表1。

表1 2组患者一般资料比较

2.2 2组NK细胞水平的比较

RIF组CD56+CD16+uNK细胞水平为(34.23±17.01)%, 低于对照组的(45.41±20.90)%, 差异有统计学意义(P<0.05); RIF组黄体中期外周血中CD56+CD16+PbNK细胞水平为(14.38±5.36)%, 与对照组的(13.58±4.34)%比较,差异无统计学意义(P>0.05); RIF组与对照组白细胞计数、淋巴细胞百分比、中性粒细胞百分比比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。子宫内膜CD56+CD16+uNK细胞水平与外周血CD56+CD16+PbNK细胞水平无相关性(r=0.06), 见图2。

表2 2组免疫细胞水平及外周血血常规指标比较

图2 子宫内膜uNK细胞与外周血PbNK细胞水平的相关性分析(相关系数r=0.06)

2.3 2组合并CE时CD56+CD16+uNK细胞比较

RIF组合并CE与无合并CE、对照组合并CE与无合并CE的黄体中期内膜中CD56+CD16+uNK细胞、外周血中CD56+CD16+PbNK细胞水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 RIF组及对照组组内合并与无合并CE时免疫细胞水平比较

2.4 2组CE治疗后妊娠结局比较

在RIF组合并CE、对照组合并CE患者中,治疗后CE转阴与CE仍为阳性者的年龄、移植日内膜厚度、平均移植胚胎数比较,差异无统计学意义(P>0.05); 在RIF组合并CE及对照组合并CE患者中,治疗后CE转阴者较CE仍为阳性者的临床妊娠率、着床率均升高,早期流产率降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 2组CE治疗后妊娠结局比较

3 讨 论

胚胎因素、子宫因素、母体免疫异常等原因均可导致胚胎着床失败。本研究结果显示,伴有CE时, RIF组及对照组临床妊娠率、着床率均下降,在经CE治疗转阴后,临床妊娠率、着床率均显著升高,早期流产率显著降低(P<0.05)。CE持续炎症的环境影响子宫内膜的容受性,相关机制可能与CE引起的内膜免疫异常、容受分子表达异常、蜕膜化异常和内膜蠕动异常等有关,也与CE患者存在病原菌感染或合并黏膜下肌瘤、息肉、子宫内膜异位症等有关[14]。因此, CE对胚胎着床的影响极大, CE的确诊和治疗应作为反复着床失败评估的重要因素。当RIF合并CE时,应合理治疗CE,而不是单纯采用免疫疗法治疗免疫细胞紊乱。

研究[15]表明uNK细胞数量在植入前和妊娠孕早期急剧上升,可达到蜕膜淋巴细胞的3/4,随着滋养细胞侵入结束及胚胎逐步形成, uNK细胞慢慢发生凋亡,数目逐渐减少、消失。本研究结果发现, RIF组黄体中期CD56+CD16+uNK细胞水平显著低于对照组,提示CD56+CD16+uNK细胞可能影响了RIF的过程。uNK细胞保护妊娠的机制可能是在胚胎植入后, uNK细胞通过表型转变和受体及细胞因子谱的改变、增强对微生物感染的抵抗、子宫螺旋动脉的重构、加强免疫耐受等途径来促进成功妊娠[16]。在种植窗时期, uNK和其他免疫细胞如树突状细胞、T-reg细胞、巨噬细胞等通过分泌正常妊娠需要的细胞因子和血管形成因子,控制螺旋动脉原位细胞的迁移,使滋养细胞向内膜适度迁移[17-18]。若滋养细胞侵袭不足,则发生免疫功能失衡,这种免疫失衡会导致外周和子宫蜕膜的慢性炎症反应,进而导致妊娠丢失等相关病理状况[19-20]。

本研究结果还显示, RIF组与对照组黄体中期外周血中CD56+CD16+PbNK细胞水平差异无统计学意义(P>0.05)。PbNK细胞是一种循环在外周血中的自然杀伤淋巴细胞,既往研究[21-22]多提示RIF患者PbNK细胞水平比正常生育史人群升高,其原因可能是血液检测的PbNK结果受患者外周血状态的变化影响[23], 从而产生偏倚。本研究检测PbNK时同时检测患者血常规状态,发现RIF组与对照组血常规中白细胞计数、淋巴细胞百分比及中性粒细胞百分比均无显著差异。此外,每个生殖机构对人体内正常的PbNK细胞水平并无统一标准,因此PbNK细胞正常范围可能非常宽泛,在该范围内对个人的妊娠状态或许没有明显的影响[24]。

本研究发现,子宫内膜CD56+CD16+uNK细胞水平与外周血CD56+CD16+PbNK细胞水平无相关性(r=0.06), 提示uNK细胞和PbNK细胞具有不同的表型和功能特征。uNK在生殖过程中扮演有益角色,是实现胚胎植入、维持妊娠的基础保障。母体淋巴细胞里的T细胞和大量独特的uNK细胞可以识别子宫母胎界面的胎盘细胞,存在多种避免T细胞损伤胎儿的保护机制,从而猜测uNK细胞的激活可能是生理性的[25]。

局部内膜炎性细胞浸润和炎症介质渗出会改变子宫内膜微环境,影响子宫内膜容受性,不利于胚胎着床,最终可能导致RIF[26]。在RIF患者中,不同表型的uNK细胞计数水平也提示不同的致病机制,而这些改变是内源性免疫功能障碍所固有的,还是由外源性因素(如微生物群和病原体的改变)引起的,目前仍有待阐明。有研究[27]显示在CE状态下,子宫内膜分泌的细胞因子等表达异常,表现为促炎因子分泌增多,抗炎因子分泌降低,影响子宫内膜细胞的增殖与凋亡,导致母-胎界面的免疫平衡被打破,同时对胚胎产生细胞毒作用,影响胚胎植入过程。另有研究[28]分析其机制为CE可能通过雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)的异常表达减弱子宫内膜基质细胞对孕激素的反应性,促进子宫内膜增殖潜能而抑制其分化潜能,影响蜕膜化的发生,对胚胎植入产生不利影响。研究发现,在RM患者中,与非CE组相比,CE对CD56+uNK细胞的比例无显著影响[29]。本研究进一步分层分析发现,在RIF组、对照组中,合并CE者较无合并CE者的黄体中期内膜中CD56+CD16+uNK细胞、外周血中CD56+CD16+PbNK细胞水平均无显著差异(P>0.05), 与前述报道相符合。黄体时期孕酮升高,该时期70%的子宫内膜是CD56+NK细胞,当黄体期即将结束时,孕酮水平下降,uNK细胞逐渐凋亡。因此,孕酮依赖的蜕膜细胞和uNK细胞的合作使基质向可接受植入的蜕膜基质转化[30]。本研究所有受试者均于B超监测排卵后第7～9天的黄体中期取子宫内膜活检标本,精确的同一时间段进行活检可以减少结果中的误差。

综上所述, CD56+CD16+uNK细胞低表达可能导致母胎界面免疫紊乱,从而增加RIF发生的风险; 外周血CD56+CD16+PbNK细胞与子宫内膜CD56+CD16+uNK细胞无相关性; 抗生素治疗CE能明显改善RIF患者的妊娠结局, CE的确诊和治疗应作为RIF评估的重要因素。