通过I.variabilis-EPSPS?基因转育培育抗草甘膦油菜研究

柳寒

摘 要：本研究利用已有的I. variabilis-EPSPS*转基因油菜资源，以优良油菜品种浙油51和早熟高油品系B57为轮回亲本，通过回交转育的方式将I. variabilis-EPSPS*基因分别导入浙油51和B57中，并对F1群体和获得的BC2F2群体进行抗性鉴定，结果显示，转入I. variabilis-EPSPS*基因后，植株对草甘膦均具有一定程度的抗性，其中以B57作为轮回亲本回交转育群体抗性表现更好，此研究为培育新型抗草甘膦油菜品种奠定了基础。

关键词：油菜；I. variabilis-EPSPS*；抗草甘膦

文章编号：1005-2690（2023）15-0001-03       中国图书分类号：S565.4       文献标志码：B

油菜是我国重要的油料作物，是世界五大食用油源之一。2021年，我国油菜播种面积超667万hm2，总产量达1 471.35万t，平均产量不足2 250 kg/hm2。油菜田草害是限制油菜产量的重要因素，会造成常年减产10％～15％，严重时达到20％[1]。

传统栽培模式中人工除草不仅耗费劳力，还会增加种植成本。施用选择性除草剂虽能达到一定效果，但由于油菜田中杂草种类繁多，往往难以达到理想效果。因而培育和推广广谱性抗除草剂油菜品种十分必要，不仅可以降低除草成本，还能增加产量和总体效益。

草甘膦是目前应用最广泛的广谱性除草剂之一，其作用靶标为莽草酸路径中的关键酶5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS），具有除草效果好、殘留量低、安全性高等优点。随着对epsps基因应用系统的不断研究，一系列转基因抗除草剂油菜新品种应运而生，并在多国取得了商业生产证书。这些品种的推广将会严重影响我国油菜在国际油菜市场中的地位。

非敏感EPSPS合酶基因I. variabilis-EPSPS*是华中农业大学从放线菌属变异居白蚁菌中克隆到的草甘膦抗性基因[2]。该基因编码的蛋白不具有CP4-EPSPS专利保护的4条保守序列，但保留了对草甘膦较高的耐受性[3]。利用I. variabilis-EPSPS*基因创制的水稻转化体可以耐受8 400 g/hm2高剂量的草甘膦，展现出良好的应用前景[4]。

本研究利用已有的I. variabilis-EPSPS*转基因油菜资源，利用回交转育的方式将I. variabilis-EPSPS*基因导入优良的油菜新品种或者新品系中，培育新型的抗草甘膦油菜品种，期望为我国油菜田的杂草治理提供新的解决方案。

1 材料和方法

1.1 试验方法和技术路线

本试验技术路线如图1所示。其中，甲HX6由华中农业大学通过农杆菌介导转化法，将改造载体pCAMBIA1300-I. variabilis-EPSPS?导入甘蓝型油菜受体甲9707中获得。所用的载体携带1.3 kb的I. variabilis-EPSPS?目的基因表达盒，其5端连有228 bp的叶绿体定位信号肽（CTP）和100 bp的UTR序列。

本研究以甲HX6为父本，与浙油51和早熟高油品系B57杂交获得F1后，以浙油51和B57作为轮回亲本回交2代后再自交1代，分别获得耐除草剂转基因油菜新材料GR51和GR57。浙油51（国审油2013017），连续多年被列为浙江省油菜主导品种；B57是近年来筛选出的早熟高油品系，含油量超过50％，其生长情况如图2所示（同一时期播种）。

1.2 抗除草剂植株检测

待植株生长至4～5叶期时，取单株幼嫩叶片，利用CTAB法提取叶片DNA，利用I.variabilis-EPSPS?基因特异引物（PP1：CTCAGGGCTCTTGGCGCTGAG

AT；PP2：TGCAATGGCCTCGGGGTGATAAC）进行PCR扩增，扩增片段长度971 bp。

1.3 抗性鉴定

温室抗性鉴定：将41％草甘膦异丙胺盐分别稀释100、200、300倍，用喷壶均匀喷洒，每个浓度为3次重复，喷施7 d和14 d后观察结果。

田间抗性鉴定：5～6叶期进行除草剂喷施试验。设3个喷施浓度，分别为中量（41％草甘膦异丙胺盐2 250 mL/hm2，大约稀释200倍，0.5％浓度）、中量的2倍量（41％草甘膦异丙胺盐4 500 mL/hm2，大约稀释100倍，1％浓度）、中量的4倍量（41％草甘膦异丙胺盐9 000 mL/hm2，大约稀释50倍，2％浓度），每个浓度3次重复，分别设置对照，喷施10 d后观察植株生长情况。

2 结果

2.1 亲本种植及F1种子的获得

将抗除草剂转基因株系甲HX6与浙油51和B57分别播在玻璃温室中。待开花初期对甲HX6套袋，防止花粉外散。

做杂交时，取甲HX6花粉涂抹到浙油51和B57去雄花器官柱头上。待柱头膨大杂交成功后，立即拔除甲HX6转基因植株。最终获得2份F1材料，分别为51 F1和57 F1。

2.2 F1种植、温室抗性鉴定及BC1F1种子的获得

将51 F1和57 F1播于50孔穴盆中，置于玻璃温室中。待生长至5～6叶期时，喷施不同浓度的除草剂（农达41％异丙胺盐制剂），以亲本B57为对照（CK），观察比较抗性情况，结果如图3所示。

从图3可以看出，对照CK喷施除草剂7 d后生长明显受到抑制，51 F1和57 F1均表现出一定的抗性。14 d后，对照（CK）全部枯萎死亡，51 F1和57 F1虽叶片出现黄化，但仍存活，同时57 F1总体生长情况好于51 F1。选择生长态势良好的51 F1和57 F1各6株种植于温室中，开花初期套袋。有足够花粉时取花粉涂抹到浙油51和B57去雄花器官柱头上。待柱头膨大杂交成功后立即拔除51 F1和57 F1植株。最终获得2份BC1F1材料，分别为51 BC1F1和57 BC1F1。

2.3 BC1F1单株抗除草剂基因检测及BC2F1的获得

将51 BC1F1和57 BC1F1分别播于50孔穴盆中。待生长至4～5叶期时，取单株幼嫩叶片提取DNA，利用I.variabilis-EPSPS?基因特异引物分别对51 BC1F1和57 BC1F1的各个单株进行检测，获得含有目标抗性基因的植株21株和14株。BC1F1单株抗性基因检测结果如图4所示。分别移栽10株BC1F1种植在玻璃温室中，与浙油51和B57再进行1次回交，获得BC2F1种子。

2.4 BC2F2的获得

将51 BC2F1和57 BC2F1分别播于50孔穴盆中，每孔1粒种子。长大后取叶片提取DNA进行抗除草剂基因检测，保留有条带的单株移栽于温室中，待开花期去顶套袋自交，只保留套袋花絮，其余花絮全部打掉。收自交种51 BC2F2和57 BC2F2。

2.5 BC2F2农达喷施试验及筛选

将51 BC2F2和57 BC2F2种植于浙江省农业科学院杨渡转基因基地，5～6叶期进行除草剂喷施

试验，由于天气原因，错过了最佳喷药时期。抽薹期進行除草剂喷施试验。按照中量、中量的2倍量和中量的4倍量进行喷施，每个浓度3次重复，分别以浙油51 和B57作为对照进行抗性比较。

喷施10 d后发现，转育的含I.variabilis-EPSPS?基因的植株抗性明显，尤其是B57作为亲本转育的抗性材料，即使是中量的4倍量喷施，药害也不是很明显。作为对照的2个受体亲本浙油51和B57均叶片发黄，最大浓度处理的植株叶片已经开始枯萎。总体来看，2个转育材料均表现出较强的抗性，表现良好。中量的2倍量喷施结果如图5所示。

3 结论与建议

本研究以华中农业大学提供的具有自主知识产权的I. variabilis-EPSPS*转基因抗草甘膦油菜甲HX6作为父本，与浙油51和早熟高油品系B57杂交获得F1后，以浙油51和B57作为轮回亲本进行连续回交后再自交进行筛选，以期获得具有草甘膦抗性的新材料。

目前，回交转育工作已进行至BC3代，获得了BC2F2代群体。在对BC2F2群体的抗性鉴定和筛选中发现，受体亲本不同，其抗性会存在较大差异。B57背景转育材料抗性略优于浙油51背景转育材料。未转育的受体亲本对照对草甘膦的反应也存在差异，浙油51较B57敏感，喷施后症状表现更快、更明显。草甘膦又名N-（磷酸甲基）甘氨酸，是一种内吸传导型有机磷类除草剂，推测不同受体间对于草甘膦的敏感性差异很可能与不同材料间的磷利用效率有关。

经农业农村部备案，有2份材料（编号分别为GR51和GR57）已经进入中间试验阶段，后续将按照中间试验规划对上述2个材料进行评价，开展转基因耐除草剂油菜GR51和GR57对靶标除草剂草甘膦的耐受性试验和对田间常用的其他除草剂（非靶标）的影响等内容，同时考察目标性状在不同世代之间的遗传稳定性、生存竞争能力及农艺性状等。

参考文献：

[1]俞琦英，周伟军.油菜田的杂草发生特点及其防治研究概况[J].浙江农业科学，2010（1）：123-127.

[2]刘子铎，易沭远，林拥军，等.一种分离的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因[P].CN103834674，2016-03-23.

[3]Yi SY， Wu GB， Lin YJ， et al. Characterization of a new type of glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase from Isoptericola variabilis[J].Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic， 2015，111：1-8.

[4] Cui Y， Huang SQ， Liu ZD， et al. Development of novel glyphosate-tolerant japonica rice lines： A step toward commercial release[J]. Frontiers in Plant Science， 2016（7）：1218.