雄激素对小鼠海马神经元细胞影响的初步观察

邓大同 张雅琪 惠灿灿 王 林

雄激素（androgen）主要指睾酮（testosterone，T）和其在体内的活性代谢产物双氢睾酮（dihydrotestosterone，DHT）。睾酮由睾丸间质细胞产生的睾酮在脑中能在5α-还原酶的作用下转化为双氢睾酮，而双氢睾酮是一种强效雄激素，其结合雄激素受体的亲和力高于睾丸激素[1]。近年来探讨雄激素与神经系统疾病的关系逐渐引起了人们的兴趣。Zhang KJ等[2]的研究显示，高水平和低水平的睾酮激素分别提高了人们在地点任务和反应空间任务上的表现。Kusters CDJ等[3]使用孟德尔随机化分析，得出较高浓度的雄激素与欧洲血统男性的阿尔兹海默病（AD）风险降低有关的结果，表明男性中的雄激素可能具有神经保护作用。一项调查70 岁日本老年人唾液睾酮浓度与无痴呆和中风的认知功能相关的横断面研究显示，唾液睾酮浓度与老年男性和女性更好的认知能力呈正相关[4]。这些研究表明雄激素参与了神经元记忆的过程，并在此过程中发挥了重要的作用。为了探究在细胞层面上雄激素对认知功能的影响，本研究对此进行研究，以初步了解雄激素影响认知功能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验细胞 小鼠海马神经元细胞系（HT22），购买于江苏省苏州市海星生物科技有限公司。

1.2 小鼠海马神经元细胞的培养、传代 小鼠海马神经元细胞置于10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中培养，置于37 ℃、5% CO2孵育箱中，细胞每2～3 天传代。传代3 次后，待细胞生长至90%，用胰蛋白酶消化离心后，加入完全培养基制成细胞悬液（细胞密度约1.5×106cell/mL），以200 uL/孔接种于六孔板（每孔细胞密度约1.5×105cell/mL），24 h后待细胞融合至50%用于实验。

1.3 试验分组以及DHT处理小鼠海马神经元细胞 ①正常对照组：于37 ℃、5% CO2孵育箱中，在10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中培养24 h，换液后继续孵育24 h。②五组不同浓度DHT处理组：于37 ℃、5% CO2孵育箱中，在10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中培养24 h后，弃去旧培养基，加入含不同浓度DHT（处理组1-5 的DHT浓度分别为0.25、0.5、1、2、4 ng/mL）的10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中继续孵育24 h。以上六组细胞的孵育条件一致，均种于六孔板上。重复三次。

1.4 细胞计数方法 细胞计数板：使用磷酸盐缓冲液将样品稀释至细胞数不高于1×106个/mL；将台盼蓝溶液与细胞悬液按体积比1∶1 混合计数；台盼蓝溶液可以渗透入死细胞细胞膜，从而分别活细胞与死细胞，只计入活细胞数；样品吹打均匀后取10 μL加入细胞计数板，每个样品设置3个重复，取平均数。

1.5 统计学分析 应用SPSS 17.0 统计软件分析数据。符合正态分布的计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠海马神经元细胞形态学观察 通过倒置相差显微镜依次各组海马神经元细胞，主要观察海马神经元细胞的大体形态，细胞之间的联系，同时比较各组细胞的形态学变化。刚接种的海马神经元细胞悬浮于培养液中，呈圆形。培养12 h后，海马神经元细胞小部分已开始贴壁生长，形态为三角形或扁平形，大多数还是处于无触角的圆形状态。培养24 h观察细胞已基本全部贴壁，贴壁后形态呈三角形、梭形不规则多边形，胞核大而圆，位置居中。加入含有不同浓度DHT的10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基后，培养24 h后，对照组（a）细胞生长迅速，相互重叠，细胞编织状排布，连接密集，生长密度约为100%；处理组1（b）细胞呈编织状排列，重叠较少，连接密集，生长密度约为80%；处理组2（c）细胞较为紧密，编织成网，部分细胞未联结，生长密度约为70%；处理组3（d）细胞大部分编织状连接，可见较多悬浮球形死细胞，生长密度约为70%；处理组4（e）细胞大部分互相连接，悬浮球状死细胞较处理组3 稍少，生长密度约为70%；处理组5（f）可见少数连接的细胞，部分细胞梭形，大部分为三角形和圆形，生长密度约为50%。见图1。

图1 海马神经元细胞在倒置相差显微镜下的形态

2.2 不同浓度DHT对小鼠海马神经元细胞生长密度影响观察 如图2 所示，经过不同浓度的DHT处理培养24 h后，小鼠海马神经元细胞的生长密度变化分别是80%-70%-70%-70%-50%，随着DHT浓度升高，小鼠海马神经细胞生长似乎呈现下降趋势。见图2。

图2 细胞生长密度曲线

2.3 不同浓度DHT对小鼠海马神经元细胞数的影响 通过表1 可见，在DHT 0.25～4 ng/mL的浓度范围内，与对照组相比，不同浓度的DHT处理组对于小鼠海马神经元细胞的生长密度存在显著差异（P＜0.05）。

表1 不同浓度DHT对小鼠海马神经元细胞数的影响（）

表1 不同浓度DHT对小鼠海马神经元细胞数的影响（）

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3 讨 论

中枢神经系统的正常生长、分化、生理和衰老的过程都受到机体内性腺激素的影响。越来越多的证据支持雄激素在大脑发育和大脑衰老过程中作为神经保护剂或神经调节剂的生物学基础，以及雄激素在涉及认知功能、情绪障碍和性冲动中的重要性。

雄激素和认知功能的影响受到广泛关注。多项中老年男性的流行病学研究表明，睾酮浓度越低，认知能力下降和痴呆的患病率和发病率越高[5-6]。老年前列腺癌患者在去势治疗后，痴呆症和阿尔兹海默病的发生风险增加[7]。然而，雄激素对认知功能的作用机制尚未完全阐明，可能与β-淀粉样蛋白的沉积、海马神经元损伤、突触可塑性改变等有关[8]。在动物实验中，Yan XS等[9]研究结果显示，睾酮治疗能够显著增加阿尔茨海默病大鼠模型Morris水迷宫实验的逃避潜伏期和路径长度。其研究通过向双侧侧脑室注射β1-42低聚淀粉样蛋白以诱导建立雄性大鼠认知功能障碍模型，继而皮下注射0.75 mg睾酮，尼氏染色、免疫组织化学、western blot和酶联免疫吸附实验结果显示，睾酮治疗后大鼠海马锥体细胞数量、海马CA1区树突棘密度、海马突触后密度蛋白95（PSD-95）的免疫应答及表达水平、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性均有不同程度的升高。并且，雄激素受体拮抗剂氟他胺能够抑制睾酮对阿尔茨海默病大鼠模型认知能力的保护作用。表明睾酮对认知功能和PSD-95表达水平的影响是通过特异性雄激素受体介导的，睾酮能够通过增加海马神经元数量和增强突触可塑性来改善AD模型大鼠的认知功能障碍。与动物实验相比，细胞实验的干扰因素较少，影响因素相对容易控制，郭国新等人采用原代培养的海马神经元细胞为研究对象，观察睾酮在短时间内对神经元树突棘密度的变化，发现睾酮可通过非基因组途径促进海马神经元的树突棘增长[10]。

体外细胞实验作为一种理想的研究模型，相比动物实验具有诸多优势，以细胞做为研究对象，去除了复杂的活体内环境影响，能够精确影响因素。本实验采用原代培养的海马神经元为研究对象，观察不同浓度DHT处理小鼠海马神经元细胞24 h后引起的细胞形态学与生长密度的改变，观察到随着双氢睾酮浓度增加到一定浓度，海马细胞生长速度有减慢趋势，这一结果与上述试验结果并不完全一致，DHT起到了抑制小鼠海马神经元细胞增长的作用，可能是由于体内双氢睾酮主要来源于睾酮在外周的代谢产物，其可通过基因组与非基因组途径分别作用于细胞核及胞浆内受体，而本实验的体外因素较为单一，后续课题组将进一步研究其变化规律及作用机制。

本课题初步观察了雄激素对小鼠海马神经元细胞影响，对于雄激素对认知功能的具体作用机制有待进一步探索。