基于0507蛋白的山羊支原体山羊肺炎亚种抗体间接ELISA检测方法的建立

李梦磊,张锐铮,于皓同,张 琪,许信刚

(西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌 712100)

山羊传染性胸膜肺炎(Contagious caprine pleuropneumonia,CCPP)被世界动物卫生组织列为必须报告的动物传染病[1-2]。该病主要临床症状表现为高热、鼻腔有黏性分泌液,个别患病羊有铁锈色鼻液,剖检可见肺脏实质硬变,甚至肺脏与胸膜发生粘连。本病在初春及秋冬季节多发,天气寒凉、营养缺乏、羊群密集等均会诱发本病[3]。山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae,Mccp)是山羊传染性胸膜肺炎的主要病原[4]。因支原体体外培养较为困难,直到1976年才分离到Mccp,并命名为F38,随后在世界其他多个国家和地区均有Mccp的分离报道[5]。Mccp 0507基因为已知Mccp的毒力基因,在长期的进化历史中未发生变化,具有较高的保守性,可作为包被抗原的选择。

近年来,随着我国畜牧业的不断发展,山羊传染性胸膜肺炎的流行呈现上升趋势,严重制约着我国羊产业的发展。因此,对传染性胸膜肺炎开展检测以及流行病学调查十分必要。本研究通过对Mccp 0507基因进行基因克隆和原核表达,将0507蛋白作为包被抗原,拟建立一种能够快速检测Mccp抗体的间接ELISA方法,进一步丰富Mccp的检测技术。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株质粒与血清样品 pet-28a(+)质粒、山羊支原体山羊肺炎亚种阳性病料由西北农林科技大学动物医学院兽医微生物实验室鉴定并保存。山羊支原体山羊肺炎亚种阳性血清、绵羊流产衣原体阳性血清、绵羊立克次体阳性血清、牛支原体阳性血清均由中国动物卫生与流行病学中心血清库提供; 山羊血清样品282份,采自陕西省部分山羊养殖场。

1.1.2 主要试剂 DNA/RNA提取试剂盒,天隆科技有限公司产品;琼脂糖凝胶DNA胶回收试剂盒、快速质粒小提试剂盒,北京天根生物科技有限公司产品;2×TaqMaster Mix,艾科瑞生物工程有限公司产品;HindⅢ、BamHⅠ内切酶,NEB公司产品;Ni-NTA His Bind Resin镍柱,上海七海复泰生物科技有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 梯度PCR仪、凝胶成像系统,莫纳生物科技有限公司产品;恒温振荡器,苏州培英实验设备有限公司产品;低温高速离心机,曦玛离心机(扬州)有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据NCBI上收录的Mccp 0507基因序列(CP006959.1),用Primer 5.0设计特异性引物(表1)。

表1 0507基因引物序列

1.2.2 0507基因的扩增及重组表达载体的构建 用DNA/RNA提取试剂盒提取Mccp阳性病料DNA,以提取的DNA为模板,用1.2.1的特异性引物进行0507基因扩增。反应体系为:2×TaqMaster Mix 10 μL,上、下游引物各1 μL,模板2 μL,其余用ddH2O补足至20 μL。反应程序为:95℃ 5 min;95℃ 30 s,56℃ 60 s,72℃ 30 s,共循环30次;72℃延伸10 min。分别用HindⅢ、BamHⅠ内切酶对胶回收后的目的片段及pet-28a载体双酶切后进行连接。并将阳性重组质粒命名为pet-28a-0507。

1.2.3 重组0507蛋白表达条件的优化 将阳性重组质粒pet-28a-0507转化至BL21(DE3)感受态细胞中,隔天挑取单菌落摇菌后进行菌液PCR鉴定,筛选出阳性表达菌株。将表达菌株过夜活化后,按照1∶100比例转接于含Kan+抗性的液体LB培养基中,在2 h左右测定OD600,当OD600为0.6～0.8时,加入不同体积的IPTG对表达菌株进行诱导,使菌液中IPTG终浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L。37℃诱导8 h后离心收集菌体,将菌体重悬后制样,经SDS-PAGE来确定最适诱导浓度。选择最适IPTG诱导浓度,对菌液进行2、3、4、5、6、7 h诱导,对不同诱导时间的菌液进行12 000 r/min离心1 min,收集菌体并重悬制样,通过SDS-PAGE筛选菌液最佳诱导时间。

1.2.4 重组0507蛋白表达形式分析、纯化及复性 在已确定的最佳诱导条件下扩大菌液量进行大量诱导,诱导后离心收集菌体与上清,用不超过原菌液体积1/25 PBS对菌体进行重悬。对重悬菌液进行超声裂解后离心,收集上清与沉淀并分别制样进行SDS-PAGE分析,以此来确定重组0507蛋白的表达形式。采用镍柱法纯化对重组0507蛋白进行纯化,采用不同浓度梯度尿素对纯化蛋白进行复性,对复性后的蛋白测定浓度后于-80℃冰箱保存备用。

1.2.5 重组0507蛋白的Western blot分析 将复性0507蛋白进行SDS-PAGE,转膜后加入50 g/L脱脂奶粉封闭2 h,在稀释后的一抗孵育液中4℃孵育过夜。次日洗膜后,在稀释后的HRP标记的二抗孵育液中室温孵育1 h,洗膜后均匀滴加ECL工作液,排出气泡后开始曝光。

2 结果

2.1 0507基因的扩增及重组质粒的构建

经PCR扩增后,琼脂糖凝胶电泳结果显示得到与Mccp 0507基因片段大小(924 bp)相一致的目的片段(图1)。重组质粒经HindⅢ、BamHⅠ双酶切鉴定为阳性(图2),表明重组质粒pet-28a-0507构建成功。

M.DNA标准DL 2 000;1.0507基因的扩增M.DNA Marker DL 2 000;1.Amplification of 0507 gene

M.DNA标准DL 5 000;1.重组质粒pet-28a-0507经BamHⅠ和HindⅢ双酶切

2.2 重组0507蛋白表达条件的优化

用不同浓度IPTG对重组表达菌株进行诱导。当IPTG终浓度为0.4 mmol/L时,重组蛋白的表达量最大(图3);在重组表达菌株进行不同时间诱导,当诱导时间为4 h时,重组蛋白的表达量最大(图4)。

M.预染蛋白分子质量标准;1.诱导的pet-28a;2～6.37℃时0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的IPTG终浓度条件下诱导7 h的重组pet-28a-0507;8.未诱导的重组pet-28a-0507

M.预染蛋白分子质量标准;1.未诱导的pet-28a;2～7.37℃、0.4 mmol/L的IPTG终浓度条件下诱导2、3、4、5、6、7 h的重组pet-28a-0507;8.未诱导的重组pet-28a-0507

2.3 重组0507蛋白表达形式的分析与纯化

在最佳诱导条件的基础上,对大量重组表达菌株进行诱导,经SDS-PAGE分析,重组0507蛋白主要存在于菌体超声裂解沉淀中,将重组蛋白进行蛋白纯化后,得到大小约39 ku的目的蛋白(图5)。

M.预染蛋白分子质量标准;1.pet-28a-0507菌液上清;2.pet-28a-0507超声裂解菌体上清;3.pet-28a-0507超声裂解菌体沉淀;4.纯化蛋白

2.4 重组蛋白的Western blot分析

经Western blot分析得到了39 ku的特异性条带,表明重组0507蛋白能与Mccp阳性血清发生特异性反应(图6)。

M.预染蛋白分子质量标准;1～2.重组N蛋白; 3.阴性对照

2.5 抗原包被量、一抗和酶标二抗稀释度的确定

当抗原包被量为3 μg/mL,一抗1∶100稀释,二抗1∶2 500稀释时,P/N值达到最大,此时为最优的工作条件(表2)。

2.6 其他试验条件优化

当封闭时间为60 min、一抗孵育时间为120 min、二抗孵育时间为60 min、TMB显色时间为20 min时,P/N值达到最大,此时为最优工作条件。

2.7 间接ELISA临界值的确定

阴性血清OD450的平均值为0.143,标准差为0.026,临界值为0.221,即当待检血清OD450≥0.221时,样品为阳性;当待检血清OD450<0.221时,样品为阴性。

2.8 特异性试验

用已经优化好的ELISA检测方法对牛支原体、绵羊立克次氏体、绵羊流产衣原体的阳性血清进行检测,结果显示阴阳对照成立,样品检测均为阴性。表明本试验所建立的ELISA检测方法能特异性检出Mccp。

2.9 灵敏性试验

将标准阳性血清进行2倍倍比稀释后,用已优化好的检测方法对稀释后的血清进行检测,当样品稀释到1∶1 024时OD450为0.227,依然大于临界值,表明本试验所建立的方法具有较低的检测阈值。

2.10 重复性试验

对阴阳性血清进行检测后,计算批内变异系数为2.8%～4.3%,批间变异系数为2.9%～5.4%,两者的变异系数均小于10%,表明本试验所建立的方法结果较稳定,具有较好的重复性。

2.11 临床样品检测

对陕西地区部分奶山羊养殖场收集到的282份临床血清样品进行检测,37份血清为阳性,山羊支原体山羊肺炎亚种抗体阳性率为13.1%。

3 讨论

山羊传染性胸膜肺炎与其他疾病具有相似的临床症状,诊断较复杂,如小反刍兽疫也会造成肺部出血性间质性炎症、支气管扩张胸腔积液[7],多杀性巴氏杆菌也会造成肺部大面积损伤。本研究所建立的检测方法对于诊断山羊支原体山羊肺炎亚种的感染具有重要意义。我国对山羊支原体山羊肺炎亚种的检测主要采用病原分离及PCR鉴定。但支原体体外培养要求较高且培养周期长不适合临床疾病的快速诊断。PCR检测具有特异性高的优点但对人员与试验条件要求较高。而ELISA检测方法操作简单且不需要特定设备,还可对大批量的血清样品进行检测。因此本试验选择建立一种间接ELISA检测方法对山羊支原体山羊肺炎亚种抗体进行检测。

由于支原体的基因组G、C含量较低,Mccp 87001全基因组测序发现 GC含量为23.68%,91.2%的密码子在摆动位置有A或T,导致75.9%的基因有TAA终止密码子[8],且在支原体表达时编码色氨酸的TGA在大肠埃希氏菌表达系统中为终止密码子,若目的基因中含有TGA则表达时会直接终止,因此,在包被抗原的选择上极为困难。经查阅文献及对NCBI上已公布的10株Mccp进行序列比对[8],发现0507基因具有较高的保守性;且基因中仅在19-21位含1个TGA,可通过引物设计将其直接突变为同样编码色氨酸的TGG[9];表明0507能够作为ELISA检测的包被抗原,可用来进行Mccp实验室诊断和流行病学调查。

本试验通过克隆0507基因,构建原核表达载体建立了一种间接ELISA检测方法。该检测方法特异性较强、灵敏度高、重复性好,对282份临床样品进行检测时有37份血清为阳性,山羊支原体山羊肺炎亚种抗体阳性率为13.1%,我国山羊支原体山羊肺炎亚种抗体阳性率范围在10%左右[10-12],本方法检测的阳性率与其一致。说明本试验建立的检测方法可用于Mccp的检测与流行病学调查。