青蒿琥酯体外抗弓形虫作用的实验研究

崔 洁,吴心悦,王小莉,杨小迪,夏 惠,沈继龙,陈兴智

刚地弓形虫作为严格细胞内寄生的一类机会致病性原虫,通过入侵温血动物有核细胞的方式引发弓形虫病[1-3]。家猫和野生猫科动物作为其唯一终宿主[4],全球阳性率大约为35%和59%[5]。既往血清学研究[6-8]显示,全球人群的弓形虫感染率高达30%。一般情况下弓形虫的致病力取决于虫株毒力、增殖能力及宿主种类,宿主在感染早期的固有免疫对感染后的结局亦至关重要[9]。作为TORCH综合征的主要病因之一,弓形虫感染对孕产妇及胎儿有着流产、致畸等重大生命威胁[10-13]。由于弓形虫复杂的生物学特性,针对弓形虫病的治疗药物显得较为不足[14-15]。磺胺嘧啶、乙胺嘧啶等传统药物存在疗程长、停药后易复发以及产生耐药性等诸多问题,经长期临床应用药物不良反应较大[16-18],因此研发低毒高效的抗弓形虫药物仍是弓形虫病治疗的重要任务。青蒿素作为我国自主研发的一线抗疟药物,有研究[19-21]显示,该类药物亦显现出较强的抗弓形虫作用。青蒿琥酯(Artesunate,Art)为双氢青蒿素半琥珀酸酯衍生物,是青蒿素主要衍生物之一。陈炘等[22]报道,Art在弓形虫脑病的治疗过程中发挥了积极作用。还有研究[23]表明,阿奇霉素(Azithromycin,Azm)与Art配伍使用取得了很好的体内抗弓形虫效果。但青蒿琥酯抗弓形虫相关的体外研究较少,且观察手段较为传统,主观性较大。本实验采用流式细胞术对药物作用后的转基因弓形虫进行检测分析,旨在为Art作为弓形虫病治疗药物提供线索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 虫株 RH-GFP株系中国农业大学动物医学院索勋教授惠赠,本室液氮保种。

1.1.2 动物 BALB/c小鼠(雌性,6～8周,SPF级)和昆明小鼠(雌性,6～8周,SPF级)购于安徽医科大学实验动物中心,动物伦理批准文号:AMU26-08061。

1.1.3 药物和主要试剂 Art为桂林南药股份有限公司产品,Azm为东北制药集团沈阳第一制药有限公司产品,吉姆萨染液为美国Sigma公司产品,RPMI-1640培养液、小牛血清和PBS均购自上海生工公司。

1.2 主要仪器设备 荧光显微镜(CX31)为日本OLMPUS公司产品。流式细胞仪(FACSVerse)为美国BD公司产品。CO2培养箱(SERIES 8000 DH)为Thermo Scientific Napco公司产品。

1.3 方法

1.3.1 RH-GFP速殖子的制备 虫株经复苏、连续传代3～4次后,取发病晚期小鼠乙醚麻醉处死,75%乙醇浸泡后沥干,充分暴露腹膜,用5 mL预冷的RPMI-1640冲洗小鼠腹腔并重复此操作2次收集腹腔灌洗液约10 mL,800 r/min离心3 min取上清液,再以3 000 r/min离心10 min,此时弃上清液重悬,分离纯化速殖子后取10 μL悬液光镜下计数,调整虫体密度备用。

1.3.2 流式检测平台的建立 为便捷有效地观察药物对RH-GFP感染宿主巨噬细胞(Macrophage,Mφ)的影响,我们将新鲜收集的RH-GFP速殖子以(1～2)×106的量经腹腔感染BALB/c小鼠,感染后72 h将小鼠乙醚麻醉处死,冲洗小鼠腹腔,以RPMI-1640完全培养基重悬细胞并接种于24孔细胞培养板,调整其密度为1×106/孔。

1.3.3 实验分组 我们设置了对照组(0.9%氯化钠溶液阴性对照);Art组,使其终浓度分别为1.562 5、3.125、6.25、12.5、25、50、100和200 μg/mL;Azm组(阳性对照),终浓度分别为12.5、25、 50、100、 200、400、800和1 600 μg/mL;Art+Azm组,终浓度分别为:Art1.562 5+Azm12.5、Art3.125+Azm25、Art6.25+Azm50、Art12.5+Azm100、Art25+Azm200和Art50+Azm400 μg/mL。各组每浓度于细胞培养板中设5复孔,每孔定容1 mL。

1.3.4 流式细胞仪检测 将24孔板置37 ℃、5%CO2细胞培养箱中孵育24 h,各孔常规制样以流式细胞仪检测感染体系中游离速殖子、感染Mφ以及未感染Mφ各组分比例变化,检测结果用FlowJoV10软件分析。

1.3.5 吉姆萨染色 按照前述方法加药孵育24 h后各孔轻柔混匀取样以1 500 r/min离心10 min,弃上清液取6 μL置无菌EP管,加入6 μL小牛血清轻柔混匀并简短离心,此时取3 μL涂片以吉姆萨染液A液与B液以1∶9比例充分混匀后滴加染色,10 min后以细水流冲洗(勿直接冲洗涂膜),晾干后油镜观察并拍照。

1.4 统计学方法 采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 RH-GFP感染Mφ流式检测平台成立 根据前期检测结果,将提纯后的(1～2)×106个RH-GFP速殖子经腹腔感染小鼠的第2～3天,腹水中Mφ与游离虫体数目的比例约为1∶1,小鼠腹腔Mφ的感染率接近50%,感染第4天,腹腔Mφ的整体数量急剧下降,游离虫体数目迅速上升(见图1)。为更加便捷,在反复预实验后确立选取感染后2～3 d的小鼠腹腔抽提物进行流式检测(见图2)。

2.2 流式检测结果 与对照组相比,Art组速殖子自3.125 μg/mL起呈梯度减少(P<0.01),50 μg/mL时,游离虫体比例已经低于0.3%(P<0.01),Mφ感染率自1.562 5 μg/mL逐渐下降,在6.25 μg/mL已明显低于对照组(P<0.01),至50 μg/mL时低于1.6%(见图3、表1)。Azm组随药物浓度递增,速殖子比例下降明显(P<0.01),在400 μg/mL时虫体比例低于0.6%,Mφ感染率低于3.5%(见图4、表2)。Art+Azm组速殖子随药物浓度升高明显减少(P<0.01),在Art12.5 +Azm100 μg/mL组,游离虫体的比例低于0.04%,此时Mφ感染率低于1.8%(见图5与表3)。

表1 梯度浓度Art作用24 h后感染体系各组分比例变化

表2 梯度浓度Azm作用24 h后感染体系各组分比例变化

表3 梯度浓度Art+Azm作用24 h后感染体系各组分比例变化

2.3 吉姆萨染色观察药物对虫体结构的损伤 对照组速殖子呈新月形或香蕉状,形态没有非常明显的变化,经吉姆萨染色后胞质呈浅蓝色而胞核为紫红色。其余各组中虫体形态、结构随药物浓度上升而逐渐崩塌。低浓度组中虫体首先呈现外形肿胀,内部出现空泡;随药物浓度增加,虫体变形明显,弓状弧消失,体内空泡增多增大呈泡沫状,部分胞膜、核膜断裂,内容物溢出;至高浓度组,虫体破碎,胞核固缩深染,胞质溶解,视野中无完整虫体存在(见图6)。

3 讨论

伴随宠物饲养的普遍性、畜牧业的发展以及饮食方式的多样化,人兽共患的弓形虫病仍是世界性的公共卫生问题。传统用药方案疗程长、根治率低、不良反应大[17-18],抗弓形虫药物的筛选任重道远。Art由我国自主研制,为青蒿素衍生物,其药理作用广泛,药物活性显著,不仅是临床一线抗疟药物,在病毒、肿瘤及其他寄生虫领域也有较强作用。有研究[22,24-25]提示,Art对弓形虫病有积极治疗作用。

本实验利用虫株胞质稳定表达绿色荧光蛋白的转基因弓形虫(RH-GFP),以流式细胞仪检测分析,相比以往台盼蓝染色后以肉眼计数虫体存活率更为准确、客观。利用此方法分析药物的的抗弓形虫作用较为创新,且该虫株在运动能力、胞内增殖速度和致病性上与野生虫株无显著差异[26]。Mφ是弓形虫感染早期宿主固有免疫屏障中的重要成员之一,与感染结局息息相关,因此观察药物对Mφ感染弓形虫后的影响极具潜在临床应用价值。有研究[23,27]显示,当Azm和Art配伍时亦获得了更好的抗虫效果。所以我们选择Azm作为阳性对照的同时又设置了Art+Azm组进行了联合用药的尝试。本实验中药物作用剂量参照以往文献报道(剂量大小较为参差宽泛)以及前期预实验结果自行设计,以10∶1→5∶1→2∶1倍比稀释梯度摸索,确立有效范围后以2∶1倍比稀释设立。为减小误差,每组每浓度设5个复孔,统计时舍去最高值和最低值,取其余三孔平均值,同时在每浓度梯度上进行了3次以上的流式检测,取3次检测结果代表。结果显示,50 μg/mL浓度Art 24 h后可达99%以上的攻虫效果,杀灭速殖子、降低Mφ感染率,而Azm在400 μg/mL时方接近此效果。联合组展现出一定优势,Art 12.5+Azm 100 μg/mL组统计结果与Art 50 μg/mL组或Azm 400 μg/mL组结果接近,同等效果下药物浓度梯度有所降低。吉姆萨染色显示,随着药物浓度的梯度上升,虫体由轻度肿胀到破裂,内部结构从轮廓模糊到深染固缩,该结果从形态学角度验证了药物的杀虫效果。

本实验结果表明,Art在体外具有较强的抗弓形虫作用,Art 与Azm联合用药亦有较佳效果,这为其作为弓形虫病治疗药物提供了实验依据。Art杀伤速殖子的机制以及对组织内包囊的效果有待进一步研究。