连翘脂素通过抑制IL-17信号改善2,4,6-三硝基苯磺酸诱导的小鼠克罗恩病样结肠炎

张紫凝,杨 子,张文静,张小凤,胡建国,5

克罗恩病(Crohn′s disease,CD)归属于炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD),以复发性肠道炎症为主要临床表现[1-2]。CD具有发病机制不明、无法治愈以及致残性等特点[3]。近年来,CD在我国的发病率呈现逐年升高趋势,但其诊疗水平却相对滞后[4]。当前可用于CD治疗的临床药物如免疫抑制剂、糖皮质激素及生物制剂等均有不同程度的不良反应,且长期使用均存在安全性和有效性等问题[5-6],因此,面对日益增长的CD治疗需求,更为安全、有效的新药物亟待开发。近年来,天然植物提取物因其疗效稳定、不易产生药物抵抗和药物依赖等优点引起了学术界的广泛关注[7]。连翘脂素(Phillygenin,PHI)是一种从木犀科植物连翘中提取的天然小分子化合物。既往研究显示,PHI可通过抑制核因子-κB(NF-κB)信号拮抗脂多糖诱导的巨噬细胞炎症反应[8],同时还能够激活过氧化物酶体增殖物激活受体-γ信号进而抑制肺上皮细胞的凋亡[9]。PHI拮抗炎症、保护细胞等多种药理学作用提示其可能具有改善CD肠炎的潜在价值。基于此,本研究首先观察PHI干预对2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid,TNBS)诱导的CD模型小鼠结肠炎的作用效果,并进一步采用网络药理学和在体实验共同分析其可能的分子机制,以期为CD临床治疗发掘新的有效药物。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取18只6～8周龄,体质量(20±3)g的野生型(Wild type,WT;C57BL/6J背景)小鼠,购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。小鼠于无特定病原菌(specific pathogen free,SPF)环境下饲养,自由进食和饮水。本研究通过蚌埠医学院动物研究伦理委员会的批准。

1.2 动物干预与分组 将WT小鼠随机分成3组:对照组(WT组)、模型组(TNBS组)和PHI干预组(PHI组),每组6只。TNBS组和PHI组均接受TNBS造模处理,造模过程:采用1%戊巴比妥钠麻醉小鼠(腹腔注射),待麻醉成功后,于小鼠肛门处涂抹石蜡油,将聚乙烯软管与1 mL注射器连接后经肛门推注2.5%的TNBS乙醇溶液(5%TNBS与无水乙醇溶液1∶1混合)100 μL,并保持头低足高位5 min[10]。PHI组小鼠在造模成功后给予PHI干预(20 mg·kg-1·d-1,灌胃),给药时间持续7 d,WT组和TNBS组小鼠每日灌胃等量的0.9%氯化钠溶液。造模后第8天处死小鼠,并采集结肠组织标本进行后续检测。

1.3 小鼠肠炎临床症状评估 采用疾病活动度指数(disease activity index,DAI)评估各组小鼠肠炎症状,评分范围为0～5分,分值越高代表症状越重[11]。造模前后称量各组小鼠体质量并计算变化量。取检时测量各组小鼠结肠长度。

1.4 小鼠结肠炎症组织学评估 收集小鼠结肠组织制备石蜡切片,行HE染色,并依据Spencer推荐的肠炎组织学评分量表评估各组小鼠结肠组织炎症程度。分值范围为0～4分,分数越高代表炎症越重。

1.5 小鼠结肠黏膜炎症介质水平检测 刮取各组小鼠结肠黏膜组织,称重后加入0.9%氯化钠溶液制备组织匀浆,再经离心获得上清液。采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测结肠黏膜组织中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)水平,实验操作依据试剂盒说明书进行。

1.6 网络药理学预测PHI作用于CD的可能分子机制

1.6.1 CD疾病靶点、PHI药物作用靶点及两者交集靶点的获取 从Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)和SuperPred(http://prediction.charite.de/index.php)数据库获取PHI潜在的作用靶点。从GeneCards(https://www.genecards.org)、DrugBank(https://go.drugbank.com)、TTD(db.idrblab.net)、PharmGKB(http-s://www.pharmgkb.org)和DisGeNet(https://www.disgenet.org/)数据库获取CD相关疾病靶点。利用VENNY(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)软件绘制韦恩图,去除重复值后,取疾病靶点和药物作用靶点的交集,即为PHI作用于CD的潜在靶点。

1.6.2 PHI作用于CD靶点的GO和KEGG富集分析 采用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)数据库对上述获得的潜在靶点进行基因本体(Gene-Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,以预测PHI治疗小鼠CD样结肠炎的可能机制。

1.7 在体验证PHI作用于CD的可能分子机制 采用免疫印迹实验对各组小鼠结肠黏膜组织中IL-17、白细胞介素-17受体A(interleukin-17 receptor A,IL-17RA)以及NF-κB激活剂1(nuclear factor kappa B activator 1,Act1)表达水平进行检测。使用RIPA裂解液裂解小鼠结肠黏膜组织,提取总蛋白后经BCA法测定蛋白浓度。用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,依次经转膜、封闭、孵育一抗(IL-17、IL-17RA、Act1或β-actin)、TBST洗膜、孵育二抗、ECL显色后使用凝胶成像系统进行曝光显影。最后利用ImageJ软件对蛋白条带灰度值进行分析,并计算相对表达量。

1.8 统计学方法 采用t检验、方差分析以及q检验。

2 结果

2.1 PHI干预改善TNBS模型小鼠肠炎症状 通过对各组小鼠肠炎临床症状进行评估发现:PHI组小鼠DAI评分低于TNBS组;PHI组小鼠体质量下降幅度、结肠缩短程度均低于TNBS组,高于WT组,差异均有统计学意义(P<0.01)(见表1)。

表1 各组小鼠肠炎症状比较

2.2 PHI干预改善TNBS模型小鼠结肠组织学损伤 基于HE染色对各组小鼠结肠组织进行病理学评分发现:PHI组小鼠结肠炎症评分(1.67±0.52)分低于TNBS组(3.67±0.52)分(t=6.71,P<0.01)(见图1)。

2.3 PHI降低TNBS模型小鼠结肠黏膜炎症介质水平 ELISA检测结果显示:PHI组小鼠结肠黏膜炎症介质水平(TNF-α、IL-6和IFN-γ)低于TNBS组,但仍高于WT组,差异均有统计学意义(P<0.01)(见表2)。

表2 各组小鼠结肠黏膜组织炎症介质表达水平

2.4 网络药理学预测PHI治疗CD的潜在作用靶点 从Swiss Target Prediction和SuperPred数据库获取PHI潜在的作用靶点,从GeneCards、DrugBank、TTD、PharmGKB和DisGeNet数据库中获取CD相关疾病靶点(见图2A);去除重复值后,取疾病靶点和药物作用靶点交集,得到交集靶点63个(见图2B)。2.5 GO和KEGG富集分析 对上述63个交集靶点进行GO和KEGG富集分析,共得到1 072条目,包括生物过程(BP)119个、细胞组分(CC)38个,分子功能(MF)32个,其中生物过程主要涉及对炎症反应的调控作用等(见图3A)。KEGG通路富集分析共得到34条通路,包括癌症通路、IL-17信号通路和趋化因子信号通路等。根据P值大小选取排名前20条通路进行可视化处理(见图3B)。其中IL-17信号通路与CD的发生发展密切相关,故我们选择IL-17信号通路进行后续的分子机制验证。

2.6 PHI改善TNBS模型小鼠结肠炎可能与抑制IL-17信号有关 采用免疫印迹实验对网络药理学预测结果进行在体验证,结果显示:PHI组小鼠结肠黏膜IL-17信号蛋白水平(TNF-α、IL-6和IFN-γ)低于TNBS组,但仍高于WT组,差异均有统计学意义(P<0.05～P<0.01)(见图4、表3)。

表3 各组小鼠检测信号蛋白水平比较

3 讨论

本研究以TNBS诱导的结肠炎小鼠为研究对象,首先通过在体实验证实PHI干预能够改善TNBS模型小鼠肠炎临床症状、结肠组织学损伤并抑制肠黏膜炎症介质水平;进一步通过网络药理学预测和在体实验验证发现PHI改善TNBS模型小鼠CD样结肠炎可能与抑制IL-17信号有关。

TNBS诱导的结肠炎小鼠是目前国内外较为公认且运用广泛的CD动物模型,具有造模周期短、诱导成功率高及肠炎稳定等特点[12]。本研究首先通过在体动物实验发现,PHI干预可显著缓解TNBS小鼠DAI评分、体质量下降幅度以及结肠缩短等症状。以上结果初步证实PHI具有改善CD模型小鼠肠道炎症的潜力。肠黏膜组织炎症细胞浸润是CD肠道重要的病理学改变[13]。本研究通过HE染色发现,PHI干预后显著抑制了TNBS模型小鼠结肠黏膜组织中炎症细胞的聚集和浸润。同时,对小鼠结肠组织炎症损伤程度进行量化发现,PHI组小鼠结肠组织病理学评分较TNBS组显著降低。以上结果进一步证实PHI对CD模型小鼠结肠组织损伤具有改善作用。此外,通过ELISA检测我们发现,PHI可显著抑制TNBS小鼠结肠黏膜组织中TNF-α、IL-6及IFN-γ的水平。CD肠道炎症反应主要由辅助性T淋巴细胞1和经典激活型巨噬细胞(M1型)介导,其可通过分泌TNF-α、IL-6及IFN-γ等促炎因子以直接损伤或诱发炎症级联反应等形式损伤肠道[14],因此,我们的实验结果分别从肠炎临床症状、组织病理学和分子层面共同证实PHI具有保护CD模型小鼠肠道炎症的作用。

接下来,我们尝试进一步探究PHI改善CD样肠炎的可能分子机制。本研究首先通过网络公共数据库获取PHI治疗CD的交集靶点,并对其进行GO和KEGG富集分析。GO-BP富集结果显示PHI主要参与炎症反应的调控过程。既往报道显示,PHI不仅可以保护小鼠足跖组织免受角叉菜胶的炎性损伤[15],还能通过调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路抑制脂多糖诱导的人肝星形细胞炎症反应[16]。我们的研究发现PHI能够显著改善TNBS小鼠CD样结肠炎,这不仅验证了网络药理学的预测结果,还进一步拓宽了PHI发挥抗炎作用的疾病应用领域。同时,KEGG富集分析结果显示,PHI改善CD样结肠炎作用可能与IL-17信号通路有关。诸多研究表明,CD病人肠黏膜组织中IL-17水平升高[17]。IL-17是一种主要由Th17细胞分泌的促炎型细胞因子,其可与IL-17受体(IL-17RA)结合传递信号,导致细胞内NF-κB激活剂1(Act1)的募集[18]。Act1是IL-17及其受体家族信号传导的关键蛋白,其可通过激活下游不同的信号通路从而诱导促炎介质(TNF-α、IL-6和IFN-γ)的表达[19]。最后,本研究采用免疫印迹实验对各组小鼠结肠黏膜组织中IL-17信号通路关键蛋白进行检测并发现,PHI能够显著抑制TNBS小鼠结肠黏膜组织中IL-17、IL-17RA以及Act1的表达水平,因此,IL-17信号可能在一定程度上解释PHI改善TNBS小鼠CD样结肠炎的作用机制。

本研究具有一定的临床应用价值。CD是一种复发和缓解交替进行的慢性炎症性疾病,手术切除病变肠管仅是权宜之计,采用药物诱导或维持肠炎缓解是治疗CD的主要手段[20]。然而,缺少更为安全、有效的治疗药物是当前CD临床治疗的主要短板[21]。我们的研究发现PHI可显著改善TNBS模型小鼠CD样结肠炎,提示其具有潜在的药物开发价值,并有望为CD临床治疗药物选择提供参考。