长枝木霉聚合根肿菌多元RNAi 靶标防治榨菜根肿病的研究

刘 颖，蔡兆明，王殿东

（长江师范学院现代农业与生物工程学院，重庆 涪陵区 408100）

榨菜（Brassica juncea）又名茎瘤芥，是一种重要的十字花科蔬菜作物，广泛栽培于中国南部地区，具有较高的营养价值和经济价值[1]。根肿病是榨菜栽培中的主要病害，对其产量和品质造成极大影响[2]。根肿病是由芸薹根肿病菌（Plasmodiophora brassicae）引起的一种土传性病害，主要危害十字花科作物，植株染病后根部首先出现病斑，随后根部肿大和腐烂，严重时会造成组织腐烂，植株死亡[3-6]。据统计，全球已有60 多个国家受到根肿病的影响，一旦染病通常会造成10%～15%的产量损失[7-9]，尤其是对榨菜产量的影响较大，严重时可造成36%以上的损失[8]。目前，根肿病的防治方法主要包括农业防治[10]、化学防治[11]和生物防治[12]。农业防治只能在一定程度上预防或缓解根肿病的症状，但是无法达到根治的目的；化学防治是现在运用最为普遍、效果也最好的防治方法，但是长期施药会给农产品安全以及生态环境带来一定风险；生物防治对农产品和环境均较安全，是现阶段防治根肿病的研究热点[13]。

MAPKs 是一类丝裂原活化蛋白激酶，MAPK基因在细胞的生长和繁殖中十分重要，根肿菌中的MAPK基因在根肿菌对植物进行表层侵染的时候起作用[14-16]。小干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA）又称短干扰RNA（short interfering RNA）或沉默RNA（silencing RNA），是一个长20 到25个核苷酸的双股RNA，在生物学上有许多不同的用途。目前，已知siRNA 主要参与RNA 干扰（RNAi）现象，以带有专一性的方式调节基因的表达，是一种常用的遗传学研究手段[17]。通过siRNA 技术对MAPK基因进行靶向沉默，从而干扰MAPK 信号通路，在植物抗病研究中取得了显著的成果[18]。王鹏程[19]通过沉默拟南芥（Arabidopsis thaliana）中MAPK2基因发现，突变体植株生长更加旺盛，并表现出与野生型不同的形态特征，例如莲座叶增多、或分层，花芽萌发时缺乏顶端优势，次级花序生长增强等。这些差异可能暗示了MAPK2 在发育过程中的作用，同时也预示着这种差异与生长素的信号转导途径的关系。然而，关于MAPK基因在根肿病发病过程中的作用报道较少。该研究旨在通过RNAi 技术对生防菌长枝木霉的MAPK1、MAPK2、MAPK3基因进行沉默，以研究MAPK基因在榨菜根肿病防治过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试生防菌为长枝木霉，供试芸薹根肿菌采自重庆涪陵榨菜种植地，保存于长江师范学院榨菜病虫害防治实验室，供试种子为涪杂2 号榨菜种子。

1.2 构建表达载体

从发病榨菜肿根中提取根肿菌孢子，提取总RNA 反转录为cDNA，以cDNA 为模板分别以MAPK1-360F/MAPK1-673R、MAPK2-776F/MAPK2-1126、MAPK3-560F/MAPK3- 885R 为引物扩增根肿菌MAPK1、MAPK2、MAPK3基因的cDNA 片段后，以MAPK1、MAPK2基因片段为模板，以MAPK1-360F、MAPK1-JR、MAPK2-JR、MAPK2-1126R 为引物扩增MAPK1和MAPK2基因融合片段，以MAPK1-360F、MAPK2-JR 、MAPK3-JF、MAPK3-885R 为引物，以MAPK1和MAPK2基因融合片段和MAPK3基因片段为模板扩增MAPK1、MAPK2、MAPK3基因融合片段；以融合片段为模板，分别以引物MAPK1-Hind3-360F/MAPK3-Xba1- 885R 和MAPK1-Bgl2-360F/MAPK3-Spe1-885R 扩增含有酶切位点的正向序列和反向序列，在HindⅢ、XbaI酶切位点处加入正向片段，在BglⅡ、SpeI酶切位点处加入反向片段到载体pDH-RH 上，构建pDH-RHMAPK 载体（图1）。所用引物序列如表1 所示，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 载体构建所用引物序列

图1 丝状真菌pDH-RH-MAPK 载体示意图

1.3 pDH-RH-MAPK 载体转化长枝木霉

供试生防菌长枝木霉首先采用液体培养获得菌丝。收集菌丝用0.7 mol/L 的氯化钠溶液冲洗至团状，按1 g 菌丝加入20 mg 崩溃酶（20 mg/mL）的量向菌丝中加入崩溃酶，在28℃、150 r/min 的条件下酶解6 h，然后用0.7 mol/L 氯化钠溶液反复冲洗后收集原生质体，再用5 mL STC 溶液（1.2 mol/L 山梨醇，50 mmol/L 氯化钙，10 mmol/L Tris-HCl）重悬。采用PEG 介导的原生质体转化方法进行转化，用含有60 mg/L 潮霉素B 的PDA 培养基筛选阳性转化子。

1.4 转基因菌株鉴定

经潮霉素B 筛选后，提取阳性转化子（即转基因的长枝木霉菌）的基因组DNA，以未转化的长枝木霉菌基因组DNA 和ddH2O 为对照，以潮霉素引物（Hyg-F：5'- AAGCCTGAACTCACCGCGAC-3'；Hyg-R：5'- CTATTCCTTTGCCCTCGGAC-3'）进行PCR 扩增，检测是否转化成功。

1.5 转基因长枝木霉菌对根肿病防效分析

将转基因的长枝木霉菌配置成浓度为1×107个/mL的悬浮液，取30 mL 转基因长枝木霉菌悬液浸根处理榨菜幼苗30 min，然后将幼苗移栽至含有根肿菌的土壤（含8×107个根肿菌）中，以无菌水和未转基因长枝木霉菌为对照，接种后40 d 取样，测量根鲜重，并统计发病株数及发病情况。根肿病病害分级标准如下：0 级，根部无肿瘤；1 级，仅侧根有小肿瘤；2 级，侧根有大肿瘤，主根有小肿瘤；3 级，主根有大肿瘤。每个处理调查20株，计算发病率和病情指数。

发病率（%）=（发病株数/总株数）×100

病情指数=[(各级病株数×相对病级数值)/(调查总株数×最高病级数值)]×100

1.6 转基因长枝木霉菌处理后根肿菌中靶标基因表达分析

收集转基因长枝木霉菌、未转基因长枝木霉菌和无菌水处理40 d 后的根肿菌（来自于发病的榨菜肿根），提取总RNA，反转录为cDNA，以根肿菌Actin2基因为内参进行荧光定量PCR（qRT-PCR），检测根肿菌中MAPK1、MAPK2、MAPK3基因的表达量，qRT-PCR 的引物序列见表2，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 qRT-PCR 的引物序列

2 结果与分析

2.1 融合MAPK1、MAPK2、MAPK3 基因的dsRNA 表达载体构建

PCR 扩增后分别得到根肿菌MAPK1、MAPK2、MAPK3基因的cDNA 片段，大小分别为314、351、326 bp（图2A），与预测大小一致，测序后基因组序列也一致，可用于后续试验。随后按照1.2 中的步骤依次将3 个基因融合，其中，MAPK1和MAPK2基因的融合片段大小为660 bp（图2B），与预测大小一致；3 个基因的融合片段大小为1 000 bp 左右（图2C），符合连接片段对应大小。

图2 3 个MAPK 基因克隆及融合片段的电泳检测结果

将根肿菌MAPK1、MAPK2、MAPK3基因融合片段分别在HindⅢ、XbaI和BglⅡ、SpeI酶切位点处正向和反向连接到丝状真菌dsRNA 表达载体上，构建木霉菌表达MAPK1、MAPK2、MAPK3基因融合片段的 dsRNA 载体，结果如图3 所示。

图3 pDH-RH-MAPK 载体正向连接和反向连接的酶切电泳检测结果

2.2 pDH-RH-MAPK 载体转化长枝木霉的结果

利用原生质体转化法，将表达根肿菌3 个MAPK基因的dsRNA 载体转化到长枝木霉菌株，挑取阳性转化子，利用潮霉素抗性基因引物进行菌落PCR 鉴定，获得阳性转化子（图4）。利用根肿菌中MAPK1、MAPK2、MAPK3基因特异引物检测3 个基因片段在转基因长枝木霉中的表达情况，发现3个基因的RNA 均在长枝木霉中进行表达（图5）。

图4 潮霉素抗性引物 PCR 检测结果

图5 荧光定量PCR 检测3 个MAPK 基因在转基因长枝木霉中的表达情况

2.3 转基因长枝木霉对根肿菌MAPK 基因表达水平的影响

采集接种转基因长枝木霉菌和对照处理的榨菜根肿病样本，分离根肿菌并提取总RNA，反转录为cDNA，通过荧光定量PCR 检测靶标基因MAPK1、MAPK2、MAPK3基因表达量，结果如图6 所示，转基因长枝木霉菌处理榨菜后可显著降低根肿菌中MAPK1、MAPK2、MAPK3基因的表达量。

图6 各处理根肿菌MAPK 基因的表达情况

2.4 接种转基因长枝木霉后对榨菜根肿病的防效

由图7 可知，各处理榨菜根肿病发病率为100%，其中空白对照组（CK）的平均鲜重为 1.37 g，病情指数为 62；接种未转基因长枝木霉处理（MM-CK）的平均鲜重为 1.30 g，病情指数为 63；接种转基因长枝木霉处理（MM-MAPK）的平均鲜重为 1.17 g，病情指数为 55，MM-MAPK 处理的榨菜根鲜重和病情指数均显著低于CK 和MM-CK 处理，而MM-CK处理的榨菜根鲜重显著低于CK，但病情指数与CK无显著差异。

图7 各处理榨菜发病肿根的平均根鲜重和病情指数

3 结论与讨论

根肿病是十字花科蔬菜栽培中危害最为严重的病害，榨菜不同于其他十字花科蔬菜，其本身是野生四倍体，这给抗病育种带来了极大的障碍。该研究所采用的长枝木霉分离自榨菜根肿病发病田，是一株对根肿病具有生防作用的菌株。通过RNAi 技术对该长枝木霉菌株中多个MAPK基因进行联合干扰，可增强长枝木霉对根肿病病原菌的抗性，显著抑制根肿菌中3 个MAPK基因的表达，从而提高长枝木霉对榨菜根肿病的防效，降低榨菜根肿病的病情指数。MAPK 蛋白通路是病原菌和植物发育和致病过程中极为重要的信号通路，参与了多种生物学过程，包括细胞分裂、生长发育、应对生物和非生物胁迫等，在植物对病原体侵染和逆境胁迫的响应中发挥了重要作用[20-22]。该研究中采取的长枝木霉聚合siRNA 策略可以同时靶向多个MAPK基因，从而达到更好的防治效果。同时，采用生防菌防治病害的这种手段专一性强、效率高、整体危害较轻，可有效减轻根肿菌对榨菜产业的危害。