基于网络药理学预测桂枝茯苓丸治疗盆腔炎性疾病后遗症的作用机制

王敏洁，徐传花

（1.南京中医药大学研究生院，江苏 南京 210023；2.南京中医药大学附属医院常州市中医医院妇科，江苏 常州 213000）

盆腔炎性疾病后遗症（sequelae of pelvic inflammatory disease，sequelae of PID）是盆腔炎性疾病（pelvic inflammatory disease，PID）的病变遗留，包括复发性盆腔炎、慢性盆腔痛、异位妊娠和不孕症等。据文献报道[1]，长期后遗症的发生率很高。极大地影响了育龄妇女的生殖健康，降低了妇女的生活质量。该病目前主要治疗方法是联合抗生素，但长期使用抗生素面临耐药性增加、疗效降低的风险[2]。因此，中医药治疗盆腔炎性疾病后遗症具有明显优势。中医并没有盆腔炎性疾病后遗症的名称记载。根据其临床表现，可分为“癥瘕”“妇女腹痛”“白带”“月经不调”“不孕”等类。根据中医学理论，该病以血瘀为基础。桂枝茯苓丸是《金匮要略》中的经典方剂，由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、白芍五味药组成，具有活血化瘀、消癥止痛、调理气血的功效，为妇人宿有癥瘕病、癥留胞宫、妊娠胎动不安、漏下不止的主方[3]。通过数据挖掘分析，张崴等[4]发现桂枝茯苓方在临床应用治疗女性生殖系统疾病的文献中排名靠前。然而，目前对桂枝茯苓丸治疗盆腔炎性疾病后遗症作用机制的研究尚少。网络药理学利用数据挖掘方法分析药物多成分、多靶点、多途径之间的相互作用。本文利用数据可视化分析方法，预测了药物在疾病治疗中的作用机理，并利用该网络研究了中药的作用机理为相关实验研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 “桂枝茯苓丸”药物化学成分及其相关靶点的收集 利用中药系统药理学数据库和分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database And Analysis Platform，TCMSP）搜索桂枝茯苓丸的有效成分，按照口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug-like，DL）≥0.18 的标准筛选所有有效成分，将过滤过的化合物输入Uniport 数据库（https://www.uniprot.org/）。确定物种为人（Human），范围为已验证（Reviewed），寻找相应的靶点蛋白，获得遗传基因名称、Uniport ID 等信息。

1.2 疾病相关靶点与药物—疾病交集靶点 通过人类基因数据库收集盆腔炎性疾病后遗症的疾病靶点，使用的关键词为“sequelae of PID”。收集到的目标导入到UniProt 数据库标准化处理。将“桂枝茯苓丸”的有效成分相关的靶点和“盆腔炎性疾病后遗症”的疾病靶点导入到Venny 2.1.0 中，获得药物-疾病交叉靶点和Venn 图。

1.3 药物-成分-疾病-靶点网络构建 以桂枝茯苓丸的有效成分靶点和盆腔炎性后遗症疾病靶点为基础，构建药物-活性成分-靶点-疾病Excel 文件，导进Cytoscape3.8.0 构建药物-活性成分-靶点-疾病网络图，从而查明桂枝茯苓丸及其活性成分、靶点与疾病的关系。

1.4 药物-疾病蛋白相互作用网络构建 将药物和疾病的交叉靶点导入STRING 软件（https://string-db.org/）中，物种仅局限于人（homo sapiens），查看并保留蛋白质相互作用关系≥0.4 数据，结果以TSV 格式导出，并使用Cytoscape 3.8.0 软件建立蛋白质相互作用（PPI）网络图。

1.5 GO 生物功能及KEGG 信号通路富集分析 利用DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对药物与疾病交叉靶点进行京都基因与基因组百科全书信号通路富集分析（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）和基因本体生物学过程分析（gene ontology，GO）。将标准设置为P小于0.05，将P-value 最小的GO 生物功能及KEGG 信号通路前20 条结果制成气泡图进行可视化分析。

2 结果

2.1 “桂枝茯苓丸”药物化学成分及其相关靶点 利用TCMSP 进行检索，并设定OB≥30%、DL≥0.18，筛选得到桂枝茯苓丸组方药物活性成分，其中桂枝7 个、茯苓15 个、牡丹皮11 个、白芍13 个、桃仁23 个，合并去重后共59 个。其中共有成分有7 个，见表1。借助TCMSP、Uniport 进行靶基因预测，删除没有靶基因的成分23 个，最终获得化学成分36 个，对应候选靶点187 个，部分候选靶点见表2。

表1 桂枝茯苓丸中各个药物的共有活性成分

2.2 “盆腔炎性疾病后遗症”疾病靶点的搜集结果通过GeneCards 数据库并结合相关文献，获得疾病靶点199 个。将桂枝茯苓丸药物成分相关靶点、盆腔炎性疾病后遗症疾病相关靶点导入Venny 2.1.0在线作图工具，共获得38 个交集靶点及韦恩图，见图1。

图1 桂枝茯苓丸-盆腔炎性疾病后遗症交集靶点及韦恩图

2.3 药物-成分-疾病-靶点网络构建 将药物-活性成分-靶点-疾病Excel 文件导入Cytoscape 3.8.0 软件并进行映射，构建药物-活性成分-靶点-疾病网络图，见图2。该网络共71 个节点，包括1 个药方节点、5 个药物节点、26 个活性成分节点、38 个作用靶标节点及1 个疾病节点，164 条边。利用Cytoscape软件中的NetworkAnalyzer 分析工具得出有效成分的Degree 值，见表3。

图2 桂枝茯苓丸治疗盆腔炎性疾病后遗症“药物-成分-疾病-靶点”网络图

表3 桂枝茯苓丸药物有效成分及OB、DL 值（Degree 值前7 位）

2.4 药物-疾病蛋白相互作用网络构建 将药物-疾病的38 个交集靶点导入STRING 软件中，设置置信度为Score≥0.400，导出TSV 数据文件，导入Cytoscape 3.8.0 软件，共得到38 个节点，810 条边，平均节点度值为42.6，连接度越大，靶点越关键，见图3。利用EXCEL 计算桂枝茯苓丸治疗盆腔炎性疾病后遗症PPI 网络中靶点的度中心性（degree centrality，DC）、中介中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）值，以不小于DC（42.63 157 895）、BC（0.012 407 144）、CC（0.715 035 917）平均值为条件，筛选得到PPI 网络的核心基因，IL6、TNF、IL1β、CCL2、TP53、IL10、EGFR、FOS、CRP 等。核心靶点蛋白互作PPI 网络图见图4，提示其可能是桂枝茯苓丸治疗盆腔炎性疾病后遗症的重要作用靶点。

图3 桂枝茯苓丸治疗盆腔炎性疾病后遗症作用靶点蛋白互作（PPI）网络图

图4 桂枝茯苓丸治疗盆腔炎性疾病后遗症核心靶点蛋白互作（PPI）网络图

2.5 桂枝茯苓丸治疗盆腔炎性疾病后遗症作用靶点GO 生物功能富集分析结果 采用DAVID 数据库对桂枝茯苓丸治疗盆腔炎性疾病后遗症作用靶点进行GO 生物功能富集分析，共获得P值小于0.05 的GO功能条目123 条，包括生物过程（biological process，BP）86 条，细胞组分（cellular component，CC）11 条，分子功能（molecular function，MF）26 条。生物过程主要在炎症应答、RNA 聚合酶Ⅱ启动子的转录正调控、脂多糖细胞的反应、一氧化氮生物合成过程的正向调控、免疫应答等方面；细胞组分主要富集在细胞外间隙、胞外区、外侧细胞膜、细胞表面、内质网膜等；分子功能主要富集在细胞因子活性、蛋白作用活性、受体信号转导蛋白酪氨酸激酶活性、血红素结合、转录因子结合、生长因子活性等，见图5。

图5 桂枝茯苓丸治疗盆腔炎性疾病后遗症作用靶点GO 分析

2.6 桂枝茯苓丸治疗盆腔炎性疾病后遗症作用靶点KEGG 信号通路富集分析结果 通过DAVID 数据库对桂枝茯苓丸治疗盆腔炎性疾病后遗症作用靶点进行KEGG 信号通路富集分析，共获得P 值小于0.05 的KEGG 信号通路71 条，根据P值对前20 条信号通路绘制气泡图，见图6。前10 位信号通路富集细节，见表4。

图6 桂枝茯苓丸治疗盆腔炎性疾病后遗症作用靶点KEGG 分析

表4 桂枝茯苓丸治疗盆腔炎性疾病后遗症前10 位信号通路富集细节

3 讨论

盆腔炎性疾病后遗症持续时间长且难以治愈。盆腔炎的发生发展经历了病原体感染、宿主免疫系统激活和抗感染因子释放3 个阶段[5]。本研究采用网络药理学方法，通过数据可视化分析发现，槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、（+）-儿茶素等成分可能是治疗盆底炎性疾病后遗症的关键药物成分。通过药物-疾病作用靶点富集分析结合相关文献的分析，发现桂枝茯苓丸治疗盆腔炎性疾病后遗症的关键靶点基因是白细胞介素6（interleukin6，IL-6）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白细胞介素1-β（interleukin 1-β,IL1β）、趋化因子配体2（C-C motif chemokine ligand 2，CCL2）、细胞肿瘤抗原（Cellular tumor antigen p53，TP53）等。

槲皮素和山萘酚均为黄酮类化合物。大量文献报道黄酮类化合物可抑制IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α，从而发挥抗炎作用。槲皮素的抗炎机制是抑制炎症因子的形成[6，7]。山奈酚可以减少炎症因子的产生，如巨噬细胞衍生趋化因子（macro phage derived chemokine，MDC）、干扰素诱导蛋白-10（interferon induced protein -10，IP-10）、白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）等，发挥抑制炎症的作用[8，9]，从而促进人体健康，预防癌症、慢性炎症、糖尿病、神经退行性疾病、骨质疏松等疾病。β-谷甾醇是一种常见的植物甾醇其抗炎作用是通过抑制表皮细胞、巨噬细胞中炎症小体NLRP3 的激活，减少CAS1 的产生及MAPK 信号通路的活化，最终造成细胞中的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 生成显著减少的结果[10，11]。儿茶素在清除自由基、调节细胞信号通路和作用于氧化酶方面发挥抗氧化作用[12]。趋化因子是具有细胞招募功能的小分子蛋白质。当炎症、损伤和病原体入侵在体内发生时，趋化因子的表达增加，免疫细胞被招募到受损部位，导致身体产生免疫反应[13]。通过对桂枝茯苓丸治疗盆腔炎性疾病后遗症的作用靶点进行KEGG 富集分析，结合相关文献，发现肿瘤坏死因子信号转导通路、Toll 样受体信号通路、肿瘤信号通路和MAPK 信号通路是盆腔炎性疾病后遗症治疗的关键通道。基于网络药理学和分子对接验证，张新庄等研究了桂枝茯苓胶囊治疗痛经、子宫肌瘤、盆腔炎的分子机制，推测桂枝茯苓胶囊可能通过多种成分作用于多种生物通路，抑制子宫平滑肌增殖、促进子宫内膜血管生成和血液循环、减少雌激素和孕激素的分泌、子宫平滑肌肉收缩和前列腺素等炎症因子的合成或释放，从而缓解痛经、减轻子宫肌瘤引起的炎症和疼痛、减少炎症反应，进一步提高患者的生活质量[14，15]。

综上所述，本研究通过网络药理学的方法，发掘和阐述桂枝茯苓丸的有效成分及其治疗盆腔炎性疾病后遗症的多成分、多靶点、多途径的机制，并初步推断桂枝茯苓丸可能通过槲皮素、山萘酚、β-谷甾醇、（+）-儿茶素等活性成分作用于IL-6、TNF、IL1β、CCL2、TP53 等关键靶点基因通过抗氧化、抑制炎症反应、抑制肿瘤细胞生长等作用机制，最终达到治疗盆腔炎性疾病后遗症的作用。然而，这项研究还存在一些不足之处，需要后期进一步的实验验证。