发育性癫痫性脑病基因治疗展望

季涛云

北京大学第一医院儿科（北京 100034）

发育性癫痫性脑病（developmental and epileptic encephalopathy，DEE）是癫痫中最为严重的一类疾病，致残率、致死率高，严重影响患儿的生活质量，给家庭和社会带来沉重负担[1]。虽然DEE中许多疾病均为罕见病，但作为一组疾病，其总体发病率为（0.27～0.54）/1000例新生儿[1-2]。DEE病因包括遗传性和非遗传性，随着技术的发展，尤其是二代测序（next-generation sequencing，NGS）技术的进步，越来越多DEE的遗传性病因被识别。本文主要阐述遗传性病因相关DEE的特点、发病机制及治疗。

1 发育性癫痫性脑病的概念

DEE 是一组神经发育性疾病，以早发癫痫、脑电图异常及发育落后或倒退为主要特征，包括早发性婴儿DEE、婴儿癫痫伴游走性局灶性发作、婴儿癫痫性痉挛综合征、Dravet综合征、Lennox-Gastaut综合征、癫痫性脑病伴睡眠中棘慢波激活、病因特异性癫痫性脑病[钾电压门控通道亚家族Q 成员2（KCNQ2）-发育性癫痫性脑病、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶5（CDKL5）-发育性癫痫性脑病、吡哆醇依赖性发育性癫痫性脑病]等[3-4]。DEE存在显著遗传异质性和表型异质性。遗传异质性是指不同遗传因素可导致相同的临床表型，例如影响不同分子或信号通路的基因变异可导致相似的电-临床综合征如婴儿癫痫性痉挛综合征。同一个基因变异也可以导致多种不同的临床表型即所谓的表型异质性，如钠电压门控通道α 亚基1（SCN1A）基因变异可导致遗传性癫痫伴热性惊厥附加症、Dravet综合征、早发性婴儿发育性癫痫性脑病等，其基因型-表型的关联与SCN1A变异是功能获得性（gain of function，GoF）还是功能缺失性（loss of function，LoF）有一定关系。除此之外，遗传背景也会改变基因型与表型的关系。相关研究发现在钾电压门控通道亚家族A 成员1（Kcna1）基因敲除和钙电压门控通道亚基α1A（Cacna1a）错义变异相结合的动物模型中，与Cacna 1 a相关的癫痫表型被掩盖，同时Kcna 1缺失变异导致的致死性表型被减轻[5]。因此，基因型-表型关联的机制复杂，尚需要大量研究以进一步明确。

2 发育性癫痫性脑病的遗传性病因

DEE的遗传性病因涉及不同功能的基因变异如细胞迁移、增殖和分化、神经元兴奋性、突触传递及神经可塑性等。随着检测技术的进步，尤其是NGS技术的普及，越来越多的DEE 致病基因得到确认，目前已有上百个基因被确认与DEE相关。除了基因变异导致的DEE 外，约8%的DEE 与新发的拷贝数变异有关[6-7]。在约10%DEE 患者的父母中检测出低比例的变异嵌合体[8-9]，上述发现对遗传咨询评估具有重要意义。非编码区变异、脑组织中存在变异嵌合体、寡基因遗传（oligogenic inheritance）和表观遗传等均可导致DEE，但是目前常用的NGS方法无法检测到上述异常。

非编码区变异主要与基因表达和调控有关，可能是由于非编码区变异导致毒性外显子产生，进而影响RNA转录本的正常剪接。有研究对640例不明原因DEE患者SCN1A基因的11个非编码候选区域进行测序，根据其进化保守性和功能特征分析，在内含子20中发现了5个变异，这些变异导致毒性外显子产生，影响全长SCN1A蛋白的正常表达[10]。有研究针对皮质发育畸形所致DEE患者的脑组织和血液配对样本进行深度测序，发现在脑组织中存在变异嵌合体[11-13]。对于大多数DEE患者来说，获取脑组织极其困难，临床实践中可能低估了变异嵌合体在DEE 中的影响。基于上述原因，已有研究试图从脑脊液中提取DNA以进行相关病因的探索[14-15]，其对于DEE的病因明确具有重要意义。寡基因遗传不符合单基因遗传的特点，而是由多个（≥2 个）基因变异相互作用导致的复杂临床表型。1个基因是主要致病基因（主效基因），而其他基因则起修饰作用。离子通道基因变异所致癫痫患者和动物模型均证实了寡基因遗传的存在[5,16-17]。有研究在1例生后3个月出现频繁癫痫发作、喂养困难、严重发育迟缓（21个月体重5.6 kg、身长69 cm、头围39.5 cm，尚不能竖头、不能发出“啊啊”声音）、最终因为强直-阵挛发作导致死亡的男性患儿中发现，同时存在KCNJ10基因及KCNT1基因的致病变异，在非洲爪蟾卵母细胞中进行功能研究时发现两种变异同时存在时会导致致死的表型[17]。

3 发育性癫痫性脑病发病机制

DEE 的发病机制复杂多样，且多重机制交织在一起可共同影响大脑发育和神经元的兴奋性。皮质和皮质下神经元相互作用，可引起正常皮质的功能改变[18]。神经元的电活动受Na+、K+离子通道相互作用的精细调节，如果平衡被打破可能会出现异常的去极化，导致异常的神经元活动和皮质兴奋性改变[19]。DEE的发生与大脑处于动态的发育过程也息息相关，在大脑的发育过程中存在分子、形态及功能的变化，发育中的大脑更容易受到多种因素的影响，更容易发生频繁、多灶的癫痫样放电及癫痫发作[20]。同时研究也发现，发育中的大脑具有更强的可塑性，与发育成熟的大脑相比，长时间癫痫发作产生严重损伤的可能性较小[21]。DEE致病基因编码的蛋白涉及多种生物学功能，如离子通道、膜运输调节、转运蛋白、细胞骨架蛋白、细胞黏附分子、细胞代谢及信号转导等（表1），其中约25%的基因参与编码离子通道，包括电压门控离子通道和配体门控离子通道。下面以编码电压门控钠离子通道相关的基因变异为例阐述DEE的发病机制。变异的功能研究对揭示病理生理机制、阐明基因型-表型关系、遗传咨询、精准治疗及长期管理具有重要意义。

表1 DEE致病基因分类

编码Ⅰ型钠通道（Nav1.1）α亚基的SCN1A是临床上最常见的癫痫致病基因之一，迄今已报道了数百种变异，其相关表型范围从表型严重的DEE（早发性婴儿DEE、Dravet综合征）到相对较轻的遗传性癫痫伴热性惊厥附加症，部分携带此基因变异的患者可表现为非癫痫表型如偏瘫性偏头痛。NaV1.1是γ-氨基丁酸（GABA）能中间神经元的主要Na+通道，位于GABA 能中间神经元的轴突初始段，SCN1A基因变异导致其兴奋性降低，降低了GABA 能神经元的抑制作用[22-23]。GABA能神经元功能的抑制与Dravet综合征相关，并且发现LoF的严重程度可以决定表型的严重程度[24-25]。研究发现，SCN1A基因变异引发的散发性或家族性偏瘫性偏头痛可能与NaV1.1功能增强有关[26-27]。基因型-表型相关性可能主要取决于SCN1A基因变异后对功能的影响，但上述关联亦受到遗传背景以及SCN1A基因变异与癫痫发作之间的相互作用等的影响，这可能是基因型-表型关联复杂的原因之一[28]。

SCN8A基因编码电压门控钠离子通道亚基Nav1.6，该通道是位于成熟兴奋性神经元轴突的主要Na+通道，是动作电位产生及传导的重要分子基础。新发的SCN8A基因杂合变异引发的临床表现复杂多样，大多数患者表现为DEE 且有癫痫猝死发生的风险[29]，部分患者表型相对较轻如表现为自限性家族性婴儿癫痫[30]，还有一些患者表现为智力障碍、孤独症谱系障碍等，而无癫痫发作。研究发现与癫痫相关的表型多与GoF 变异相关，此种变异导致神经元兴奋性增强；而无癫痫发作的智力障碍、孤独症谱系障碍多与LoF变异相关[31-32]。上述研究对治疗有一定的指导作用，如部分SCN8A基因GoF变异的患者对高剂量的钠通道阻滞剂有一定反应[30,33]。

编码钠离子通道基因SCN1A、SCN2A、SCN3A、SCN8A均可导致DEE，但是SCN1A基因主要在抑制性神经元中表达，而同样编码电压门控钠离子通道的SCN2A、SCN3A、SCN8A在大脑多个区域的兴奋性神经元中优先表达[34]。体外和体内电生理研究对于确定通道相关基因变异的功能影响至关重要，变异后功能的改变在相同基因家族中可能不同，甚至在相同基因中也可能不同。功能研究为药物选择和研发提供了重要的基础。

4 发育性癫痫性脑病治疗

目前DEE 治疗主要是对症治疗，包括针对癫痫发作的抗癫痫发作药物的应用，以及针对发育落后的康复治疗。在部分DEE 患者中，即使癫痫发作得到较好的控制，但发育障碍和其他合并症仍然较为严重[35]。随着人们对疾病发病机制研究的逐渐深入，发现许多疾病是由于遗传物质改变所致，例如某一基因的变异导致蛋白表达异常，从而引起病变。基因治疗可通过修复致病基因达到缓解和治愈疾病的目的，为DEE 患者带来了新的希望。目前常用的基因治疗方法包括：①使用病毒载体的基因替代治疗；②调节基因表达，如反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASOs）治疗脊髓性肌萎缩症；③基于成簇的规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）的基因编辑疗法。

腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）是目前基因治疗的主流病毒载体。在SCN1A变异所致Dravet 综合征的小鼠中注射AAV9-REGABAeTFSCN1A(ETX101)可显著降低无诱因和发热诱发的癫痫发作的发生率，并延长其生存期[36]。在结节性硬化症的小鼠模型中应用AAV1-环化重组酶以及AAV9-错构瘤蛋白，小鼠生存期延长，脑病理异常亦显著减少[37]。也有研究在Cdkl5变异导致的小鼠模型中注射AAV-PHP.B-hCDKL5_1，注射后小鼠脑中CDKL5 表达有所恢复且运动功能有改善[38]。ASOs是一种与特定靶mRNA互补的单链脱氧核酸，包含12～28个碱基，通过与mRNA或前mRNA序列互补，ASOs 可被合成为DNA/RNA 异源双链体，成为影响蛋白质编码和非编码核糖核酸的疾病修饰剂，降低毒性蛋白质水平，增加功能蛋白质的水平或修饰受损蛋白质的结构以改善功能[39]。2020年相关研究发现用ASOs治疗Scn8a基因变异的R1872W小鼠，延迟了其癫痫发作起病时间，并延长了其存活时间[40]。在Dravet综合征动物模型中，通过反义寡核苷酸靶向增强核基因输出（targeted augmentation of nuclear gene output，TANGO）可增加Scn1a转录物和Nav1.1蛋白的表达，从而降低癫痫发作的频率、延长寿命且能将中间抑制性神经元的兴奋性恢复至野生型的水平[41-42]。STK-001是用于治疗Dravet综合征的ASOs药物，可选择性上调SCN1A基因的一个等位基因，从而增加NaV1.1 蛋白质的产生，STK-001应用于Dravet综合征患者的临床研究正在进行中[43]，期待能为Dravet综合征提供新的有效治疗药物。CRISPR 是一种基因编辑技术，该技术通过修复或敲除变异基因和编辑其他相关基因来治疗疾病。它使得在细胞和组织中快速、廉价和相对容易纠正基因组中的错误成为可能。CRISPR突出的优势是具有治疗由单基因变异引起的遗传疾病方面的潜在用途。目前CRISPR已应用于阿尔兹海默症、杜氏肌营养不良、Dravet综合征等疾病的动物和细胞实验。在CRISPR的潜力转化为临床有效治疗之前，仍然存在许多挑战，如该技术的递送效率、脱靶效应、安全性等[44]。

DEE 表型复杂，致病基因种类繁多，以上特点导致其基因治疗的研究和临床应用面临更大挑战和困难。随着相关技术的进步，应加强对该疾病的基础性研究，通过对变异的功能研究揭示其病理机制和阐明基因型-表型相关性至关重要，有助于开展进一步的基因治疗研究。递送技术是基因治疗过程中的关键技术，现已开发更多有效的非病毒载体，如细胞外囊泡、脂质纳米颗粒及类病毒体等，其技术进步将极大推动基因治疗的应用范围，还将有助于进一步降低生产成本。基因治疗在DEE中的应用目前仍存在以下问题[45]：①由于大多数DEE与广泛的大脑功能障碍有关，因此需要针对整个大脑进行递送；②DEE 发病机制复杂，与LoF 或GoF 有关，过量表达可能导致不良影响；③DEE发病部分与体细胞嵌合有关，导致替代治疗的量和分布更加复杂；④治疗窗口期非常重要，基因的替代治疗应该在脑神经网络发育成熟之前进行。虽然目前基因治疗还存在诸多问题，但相信随着科学技术的进步，上述问题将会迎刃而解。

5 结语

癫痫是最常见儿童神经系统疾病之一，根据起病年龄、癫痫发作类型、脑电图特征、病因、合并症及预后，可以分为不同的癫痫类型和癫痫综合征。DEE 是其中最为严重的类型之一，严重影响患者及其家庭的生活质量。DEE表型多样，病因复杂，针对致病机制的研究结果为我们提供了更清晰的靶向目标，为研究安全有效的治疗方法提供了基础，针对病因的个体化基因治疗未来可期。