基于BSA重测序的辣椒CMS恢复基因连锁分子标记开发

王萌 赵虎 徐晓美 潘尧铧 赵曾菁 吴星 王日升

关键词：辣椒；全基因组重测序；胞质雄性不育；恢复基因；分子标记

辣椒（Capsicumspp.）是世界最大的调味料作物和世界第三大蔬菜作物，也是我国种植面积最大、加工方式最多、消费功能最多的蔬菜和最大的调味品[1]。目前辣椒杂交制种生产仍较多采用人工去雄，种子生产成本高，与国外品种相比缺乏市场竞争力[2]。利用辣椒胞质雄性不育（CMS）进行三系杂交制种不仅可以确保杂交种子纯度，更有利于保护品种的知识产权，是辣椒育种发展的主要趋势[3]。开发与辣椒CMS恢复基因紧密连锁的分子标记，大规模对自交系及中间材料进行恢复基因筛选，可大大提高三系育种效率。

辣椒CMS育性恢复的遗传控制多样且复杂，多数研究者认为辣椒Rf基因由1个显性基因控制的[4-5]，WEI等[6]认为辣椒CMS恢复基因（Rf）是受2个主加性－显性上位基因和1个加性-显性多基因控制，也有认为辣椒CMS育性恢复与1个主QTL和4个小QTL有关[7]。针对辣椒Rf基因，前人已经开发了多种类型的分子标记用于辅助育种，这些标记包括随机扩增多态性（RAPD）标记[8]、简单重复序列（SSR）标记[9]、插入/缺失（InDel）标记[10]、切割扩增多态性序列（CAPS）标记[11]、序列特征扩增区（SCAR）标记[12]和竞争性等位基因特异性PCR（KASP）标记[6，13]等。其中应用最广泛的标记CRF-SCAR[12，14]在不同自然群体中对育性恢复性状的准确率最高，同一標记在不同群体间准确率差异较大，准确率较高的报道有89.1%[4]、79.2%[15]和100%[16]。这些结果进一步说明，辣椒基因组包含多个候选Rf基因，不同恢复系可能具有基因型特异性的Rf基因[11，15，17-18]，目前尚无通用标记，特异的恢复基因需要开发相应的标记才更有效。

目前，最广泛使用的CRF-SCAR标记[15，17]不能区分本单位的不育系014A和恢复系014C，说明恢复系014C可能具有不同Rf基因，需要开发相应的连锁标记。深度测序结合BSA法，在不构建遗传图谱的情况下，可快速定位正向遗传学的性状位点[19]，快速筛选目标基因以获得紧密连锁分子标记[20]，目前已用于多种作物质量性状或主效基因的定位，如尹明智等[21]利用该方法定位了油菜野芥胞质雄性不育恢复基因；LI等[22]利用BSA法结合基因组测序和转录组测序，联合分析获得了大白菜中与叶状头形成相关的共同候选基因。本研究以不育系014A和恢复系014C构建了F2分离群体，利用BSA法结合全基因组重测序，获得辣椒CMS恢复基因相关定位区间，根据区间内的差异SNP/InDel设计引物，筛选恢复基因连锁分子标记，为加速选育辣椒CMS恢复系奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

以不育系014A×恢复系014C构建F2分离群体，正常田间管理，于花期调查育性，构建测序所需基因可育混池和不育混池，可育混池单株分别隔离，单株留种，每个单株种植30个子代，调查育性分离情况，判断可育混池内单株基因型为RfRf或Rfrf。试验材料种植于广西农业科学院基地。

1.2方法

1.2.1育性调查2020年对F2群体1008个单株进行插牌编号，田间正常管理，于辣椒开花期开展3次以上育性调查并记录，参考花粉指数（PI）法：根据肉眼观察花粉数量分为1～4级，每株调查10朵花，在开花当天进行观察。1级：花药上布满花粉，同可育亲本无明显差异；2级：有花粉，但不及可育亲本的一半，花粉量明显减少；3级：有很少量的花粉；4级：花药干瘪皱缩，无可见的花粉。对于不易判定等级的调查的单株，采用多次调查的方法，同时调查自然坐果率和果内种子数量进行辅助判断并记录。

1.2.2建池、测序与数据处理在F2群体采集单株叶片提取DNA，同时分别选择1级和4级各30个单株，分别取幼嫩叶片0.1g用于DNA的提取，DNA分别等量混合构建不育基因池和可育基因池。2个混池连同亲本建库后使用HiseqX10PE150上机测序，测序深度为30×。样本由广州基迪奥生物科技有限公司完成建库和测序。测序得到的原始数据先进行过滤，获得cleanreads，再利用Burrows-WheelerAligner（BWA，v0.7.16a-r1181）将过滤后的reads与辣椒参考基因组Ensembl_release47（http：//plants.ensembl.org/Capsicum_annuum/Info/Index）进行比对。比对结果使用GATK（v3.5）VariantFiltration模块对SNP和InDel进行变异检测。

1.2.3基于SNP-index的BSA分析与Fisher精确检验对辣椒育性连锁定位区间进行筛选时，首先过滤不育和可育混池中SNP-index均小于0.3或大于0.7的位点，计算各混池的SNP-index和混池间的Δ（SNP-index），然后以滑动窗口法对Δ（SNP-index）在各个染色体上的分布制图。置信区间设置为95%和99%，取正向置信水平99%以上窗口作为候选区间[23]。

采用Fisher精确检验法（SPSS21.0）对2个混池中的等位基因深度比例进行检验，显著性使用P值表示，再次按照滑窗的方法对计算获得的P值结果进行拟合，取P值的-log10后绘制曼哈顿图。原始的P值进行FDR校正后获得q值，筛选q值小于阈值（0.05）的位点作为显著位点，连续的显著位点合并成一个区间，获得显著区间。

1.2.4DNA提取与引物筛选采用改良的CTAB法提取亲本及F2群体所有单株DNA，检测合格后将浓度统一调整至50ng/μL用于后续试验。根据定位区间获得的基因、InDel/SNPs信息，结合前人报道恢复基因类型信息，每个基因至少设计1对以上的引物，优先选择位于外显子区域的SNP和多态性差异5bp以上的InDel作为第一轮SSR/InDel分子标记，筛选在亲本间呈现多态性的引物。在第一轮多态性引物附近，第二轮根据基因信息和InDel/SNPs设计更多的标记，再次利用双亲进行标记筛选，然后结合F2、F3育性田间调查结果，利用确定了基因型的30个可育混池单株（基因型为RfRf或Rfrf）、30个不育混池单株（基因型为rfrf）进行筛选，获得准确率最高的分子标记，最后使用F2群体进行准确率验证。

提取目标位点两翼各150bp的碱基序列，使用Oligo6软件进行引物设计。引物序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应总体系均为10μL，其中50ng/μL模版DNA1μL，TaqDNA聚合酶5μL，上下游引物（10μmol/L）各0.5μL，ddH2O3μL。PCR扩增程序参照王日勇等[24]的方法。扩增产物用8%变性聚丙烯酰胺凝胶110V电泳分离95min，用银染法进行显影；根据标记特征，分离群体内验证也可使用2%琼脂糖，电压120V，电泳35min；观察结果并拍照保存。

2结果与分析

2.1F2代分离群体育性调查

通过不育系014A和恢复系014C杂交构建的F2代分离群体1008个单株育性调查结果表明，花粉正常可育单株为785株，不育的单株为223株，可育、不育分离比例均接近3∶1，按1对基因的控制模式分别进行χ2测验，χ2值为1.341，P值为0.247，P>0.05，符合理论预测，即可育和不育分离比符合3∶1的分离规律（表1），表明辣椒CMS育性恢复性状受1对显性基因控制。30个测序用的极端可育单株通过种植调查F3群体分离情况，育性不发生分离则亲本为纯合可育（RfRf），育性发生分离则亲本为杂合可育（Rfrf），连同30个纯合不育单株（rfrf）用于后续分子标记筛选与验证。

2.2重测序混池数据质量评估

根据亲本和混池重测序的相关数据结果显示（表2），此次测序共得到450.60Gb原始数据，经数据质控过滤后获得448.27Gb高质量有效数据。样品的GC碱基含量为36.08%～36.84%，测序质量控制标准Q30>93.75%。不育、可育测试样品与参考基因组的比对率分别为97.84%、97.67%。基因组覆盖度20×比例约为80%以上。全基因组范围内分别检测到950253个InDel和15142397个SNP。由此可知，本研究样本数据量足够，GC分布正常，测序质量合格，测序数据与参考基因组比对结果正常，覆盖度饱和，可用于后续的变异分析及目标性状的基因定位。

2.3与辣椒CMS育性关联的连锁区间定位

基于SNP-index的BSA分析结果显示，正向置信水平99%以上窗口有12个区间分别位于6号、8号、11号染色体上（表3，图1）。由图1可知，6号染色体定位区间峰值高、峰形宽大，8号染色体存在多个小峰，11号染色体也存在一个峰值高的狭窄峰。由表3可知，6号染色体的第一个定位区间最大，长度为26.72Mb，约占总区间长度32%，其中包含540个基因，约占基因总数的64%，基因分布相对集中。

为进一步缩小定位区间，采用Fisher精确检验法对2个混池中的等位基因深度比例进行检验，得到基于-log10（p）值的全基因组分布曼哈顿图（图2），获得的定位区间为6号染色体1.44～8.28Mb，该区间内包含4441个SNP、266个Indel和227个基因。

2.4分子标记开发

根据6号染色体1.44～8.28Mb候选区间内227个基因及SNP/InDel位点，共设计了316对引物，扩增亲本，筛选出27对在亲本间差异显著的标记。根据基因注释获得的3个恢复基因候选基因，然后重点在这3个基因附近设计引物并筛选，最终获得了能稳定扩增出特异条带的标记OP59和PP5。OP59引物序列为F：5-TGGAACAGAGTCATATTTTTCTTTCAT-3、R：5-CCAATTCCGATAAAGGGTTTT-3。PP5引物序列为F：5-TCATTCTTTAGGGGAAGCTTAGG-3、R：5-CGGTGTGGACAGACATTTCA-3。根据SNP位点设计的标记OP59，在纯合可育材料可扩增出282bp条带，不育材料可扩增出278bp条带，杂合单株能扩增出2条带（图3）。根据InDel位点设计的标记PP5，在不育亲本、F2杂合可育单株、不育单株中均可扩增出约300bp的条带，而纯合可育亲本和F2纯合可育单株中无扩增条带，该标记可使用琼脂糖电泳更方便快速（图4）。2个标记在极端群体验证中准确率均达到100%。

将这2个标记在F2代分离群体随机挑选的456个单株进行验证，结果表明，2个标记在重测序的极端群体中准确率均达到100%。共显性标记OP59在不育的群体中准确率为100%，在可育单株中准确率为97.21%。標记PP5在不育单株和纯合可育单株中准确率均为100%。根据与参考基因组比对结果，标记OP59根据位于6号染色体3877192bp处SNP位点设计，参考碱基为A，突变碱基为G，该位点位于恢复基因候选PPR基因T459-15819基因间区，距离为17232bp；标记PP5根据位于6号染色体3897138bp处InDel位点设计，参考碱基为G，突变碱基为GT，该位点位于该基因下游318bp。

3讨论

本研究表明，辣椒CMS核内恢复基因经BSA结合法结合全基因组重测序，比对参考基因组Ensembl_release47，经Fisher精确检验，定位在6号染色体顶端1.44～8.28Mb区间，区间长度6.84Mb。WEI等[6]通过基于转录组测序的BSR-seq方法，通过与参考基因组Zunla-1比对，将恢复基因定位在6号染色体末端16.8Mb的区间，其使用的试验材料包含的恢复基因被认为是受2个主加性-显性上位基因和一个加性-显性多基因控制。ZHANG等[25]也是使用BSA结合基因组重测序的方法在6号染色体的两端分别获得了一个恢复基因，该材料中辣椒CMS育性恢复同时受2对基因控制。本研究所使用的试验材料F2群体中可育∶不育符合3∶1，因此育性恢复受1对基因控制，这与WEI等[6]、ZHANG等[25]的试验材料不同，推测确实含有不同的恢复基因。

在许多农作物中多个雄性不育恢复基因（Rf）已经被鉴定，大多数恢复基因属于PPR基因（编码蛋白含有五肽重复序列），如水稻[26]、油菜[27]、棉花[28]等。在辣椒作物上，前人报道的恢复基因有PPR6[11]、PPR46[11]、NEDD8[18]、长链非编码RNA[29]等。尹明智等[21]通过对基因定位的候选区域进行序列分析和基因注释，发现其中的PPR基因，再进行基因克隆及功能验证，这将是分析恢复基因的一种有效手段。本研究初步获得的候选基因T459-15819也是属于PPR基因，该基因是否为调控辣椒育性恢复的关键基因，以及如何影响育性的恢复还需进一步分析验证。

本研究获得的标记OP59属于共显性标记，不仅能够区分基因纯合可育（RfRf）植株和不育（rfrf）植株，还能鉴定出杂合可育（Rfrf）的植株，且准确率高，聚丙烯酰胺凝胶电泳即可分辨，在实际应用中非常简便有效。标记PP5琼脂糖凝胶电泳检测即可，实际应用中可先用PP5检出纯合可育株，然后再用OP59检出其他类型。

本研究构建的F2群体中，根据花粉指数法将单株划分为不同的等级，花粉量减少的2、3、4等级全部归为不育，经χ2测验，可育和不育分离比符合3∶1，推测辣椒CMS育性恢复性状受1对显性基因控制，这与多数研究结果一致[4-5，9，14]。从本研究不育群体实际调查数据来看，单株间花粉量存在一定的差异，因此，本研究使用的恢复基因除受1对显性基因控制外，在6号、8号、11号染色体上也可能存在育性修饰的微效基因，或基因表达受到环境影响，仍需进一步研究。