浅谈影响禽流感血凝和血凝抑制试验结果的因素

倪兴维 汪忠荣 张霞 徐婷婷 李照伟 毛以智 刘霞

摘  要：禽流感血凝和血凝抑制试验是评价禽流感疫苗免疫效果最常用的方法，具有操作简单、结果判定快速且不需要特殊的仪器设备等优点，但该试验在实际操作中受多种因素的影响，笔者结合临床工作经验，初步探讨影响禽流感血凝和血凝抑制试验结果的因素。

关键词：禽流感；血凝；血凝抑制；因素

中图分类号：S831.7 文献标志码：A 文章编号：1001-0769（2023）04-0031-03

高致病性禽流感是严重威胁全球养禽业健康发展的禽病之一，世界动物卫生组织将其列为必须通报的动物疫病，我国农业农村部将其列为一类的动物疫病。2004年开始，我国对H5亚型禽流感实施强制免疫[1]，2017年秋季开始对H7N9禽流感实施强制免疫[2]，并要求开展免疫效果评价，为制定相应的禽流感防控措施提供依据。

禽流感免疫效果评价最常用的方法是血凝和血凝抑制试验，该方法具有操作简单、结果判定快速且不需要特殊的仪器设备等优点，因此被基层兽医实验室、养殖场等广泛使用。该试验操作过程需参照统一的国家标准，即《高致病性禽流感诊断技术》（GB/T 18936-2020）（以下简称《诊断技术》）。《诊断技术》中明确规定了禽流感血凝和血凝抑制试验的操作步骤、结果判定、注意事项等相关内容，但该试验在实际操作中受多种因素的影响，存在同一样本不同检测人员出现检测结果不同的现象。为此，笔者结合临床工作经验，初步探讨血凝和血凝抑制试验结果的影响因素。

1  被检样本对试验结果的影响

被检样本出现溶血、腐败、含有非特异性物质等现象，均严重影响试验结果。因此，采样后将样本倾斜放置，自然析出血清，避免摇晃，防止溶血；若血清样本不能及时进行检测应冷冻保存，冷冻后的血清应避免反复冻融，以免腐败变质。

2  红细胞悬液制备对试验结果的影响

红细胞悬液浓度、纯度及配制时间均会影响试验结果。按照《诊断技术》要求，该试验使用1％红细胞悬液，红细胞应来源于3羽无特定病原体（specific pathogen free，SPF）公鸡，但在实际过程中，很难找到能够符合SPF公鸡标准的公鸡，为此可增加红细胞洗涤次数，通过眼睛观察洗涤并离心的红细胞悬液，上清液以清澈为准；采集血液时加入抗凝剂的量应适中，過多会抑制凝集现象的产生，影响红细胞结果，过少易产生血凝块，影响试验观察；血液采集后沿管壁缓慢打入离心管中，避免用力过猛而破坏红细胞结构；洗涤离心时转速不易过高，一般为2 000ｒ/min，离心5～10 min，最后一次离心10 min；配制1％红细胞悬液时，吸取压积红细胞应从离心管底部吸取，但不能将移液器枪头尖贴紧底部，且吸取速度应缓慢，转入磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）中时应悬空缓慢加入，且避免吹打清洗枪头。1％红细胞悬液应尽可能现配现用，确需延长使用时间时，应冷藏保存，且时间一般不超过3 d。

3  四单位抗原配制对试验结果的影响

四单位抗原配制时间和浓度均会影响试验结果，因此使用前应按照《诊断技术》介绍的方法进行四单位验证。使用现配四单位抗原和提前配制四单位抗原，试验结果会出现极显著差异，其主要原因是抗原在空气中暴露时间长，导致活性降低，且抗原液的溶剂随着时间延长而蒸发，使抗原液浓度增大，导致试验结果偏大。因此在实际操作过程中，应合理安排四单位抗原配制时间，尽可能做到现配现用，降低误差。此外，四单位抗原配制时，吸取转移浓缩抗原应先在浓缩抗原瓶中吹打枪头2～3次，吸取速度应缓慢，转移到PBS缓冲液中时应悬空加入，且避免吹打清洗枪头。

4  移液器的使用对试验结果的影响

整个试验过程经常使用移液器，因此移液器是否正确使用将直接影响试验结果。在试验过程中，移液器要垂直使用，但在实际操作过程中尤其是大量检测时，几乎不能按要求正确使用，因此在使用移液器时可以有一定的倾斜，但应保证每次倾斜角度大致相同；在吸取转移试剂或样本时，应先在试剂或样本中吹打2～3次以润湿枪头（配制1％红细胞悬液除外）再吸取；在倍比稀释抗原和样本时，每孔的稀释方式（一档吸一档打还是一档吸二挡打）、稀释次数、稀释力度、稀释时间、枪头在反应孔内的深度等均尽可能相同；加入1％红细胞悬液时枪头在红细胞瓶内吸取的位置尽可能一致，且红细胞瓶应不断摇匀，确保每孔红细胞悬液浓度一致；在反应孔中加入1％红细胞悬液、四单位抗原等试剂时，移液器使用力度不易过大但要干脆利落，避免试剂与孔壁或孔内液体相冲，导致加入液体反弹回孔外，且按照从低倍到高倍的顺序加入，避免交叉污染。

5  其他影响因素

试验中使用振荡器时，振荡力度不易过大，否则易破坏红细胞或抗原、抗体原有结构，导致结果出现误差；在判定血凝和血凝抑制结果时，避免反复颠倒反应板，且严格遵守完全凝集和完全抑制凝集这一标准。

影响血凝和血凝抑制试验结果的细节环节很多，涉及样本的采集保存、试剂配制、移液器使用、结果判定等多方面。因此，在实际检测过程中，除严格按照《诊断技术》中的要求进行操作外，还应注意操作中的细节，从而提高试验结果的准确性，真正做好禽流感抗体检测和疫苗免疫效果评价，为禽流感防控工作提供可靠的数据支撑。

参考文献

[1] 关于印发2004年国家动物疫病监测与流行病学调查计划的通知[Z]．北京：农业部．2004.

[2] 农业部关于切实做好全国高致病性禽流感秋季免疫工作的通知[Z]．北京：农业部．2017.