化学修饰电极在黄酮类化合物快速检测中的应用研究进展

尹红果, 贺灵芝, 彭栋梁, 李亚军*

(1.湖南环境生物职业技术学院 医药技术学院,湖南 衡阳 421005;2.古汉中药有限公司,湖南 衡阳 421008)

黄酮类化合物(flavonoids)分布广泛,结构多样,常存在于天然药用植物中,通常具有抗炎、抗癌、抗过敏、降血脂等多重药理活性[1],被广泛应用于药品、食品中发挥预防和治疗疾病作用[2-4]。目前,面向黄酮类化合物的常用定量检测方法有电化学分析法、分光光度法[5]、薄层色谱法[6]、高效液相色谱法[7]和毛细管电泳法[8]等。相比而言,电化学分析方法因易操作、耗材少、前处理简单、响应速度快以及可实现原位在线检测等优点受到研究者们广泛关注。目前,面向药物检测的电化学分析方法,除了部分抗生素类药物应用抗原、抗体和免疫传感器测定,其他药物分子检测常用化学修饰电极测定法[9]。

化学修饰电极(chemically modified electrodes,CMEs)一般是指由性能优良的导体、半导体制成的电极,制备时将目标离子、分子(单分子或多分子)、聚合物滴涂于电极表面形成化学物质薄膜,就可以凭借电荷消耗反应,表现出电极表面修饰薄膜的电化学行为或现象。化学修饰电极自1975年由Murray[10]首次报道以来,突破了传统电化学方法对“裸电极-溶液界面”的物理化学研究范畴,也意味着可以从化学状态上借助电极表面的分子裁剪,人为控制电极表面结构,从而改变电极功能,从分子水平上设计电极。化学修饰电极因选择性好、灵敏度高、样品消耗量少、操作简单、易微型化等优良特征[11-12],已成为电化学检测领域的研究热点,在天然药物分子检测中更是展现无限前景。

1 化学修饰电极检测黄酮类的方法和原理

1.1 黄酮类化合物结构特点

黄酮类化合物在2-苯基色原酮母核结构的基础上,可衍生出含羟基(—OH)、甲氧基(—OCH3)、甲基(—CH3)、糖苷、异戊烯基等官能团的不同结构类型,通过这些化合物中特有官能团的氧化还原性质,可以利用基于化学修饰电极的电化学方法研究其电化学行为。例如,芦丁和木犀草素分子结构中均含有邻位二羟基和5-羟基黄酮结构,不仅可以发生氧化还原反应,还能与多种金属离子发生配位反应;黄芩素分子中含有邻三酚羟基结构,易发生氧化反应生成醌式衍生物。图1为黄芩素在Cu@Co双核MOFs修饰电极上的反应机理图[13]。

图1 Cu@Co双核MOFs修饰电极的制备流程及其与黄芩素的反应机理图[13]Figure 1 Preparation process of Cu@Co binuclear MOFs modified electrode and its reaction mechanism with baicalein [13]

1.2 检测方法及原理

化学修饰电极主要采用电化学研究中最常用的三电极体系装置,如图2所示,三电极分别是参比电极(RE)、工作电极(WE)、对电极(CE),其中工作电极上的电化学反应是分析检测的研究对象,也是进行化学修饰的目标电极。根据化学修饰材料与工作电极表面的作用方式不同,一般将化学修饰电极分为吸附型、共价键合型和聚合物薄膜型三种类型[11]。

图2 三电极体系[25]Figure 2 Three-electrode system[25]

目前,电化学分析方法中,常用于黄酮类化合物检测的有循环伏安法(CV)[14]、差分脉冲伏安法(DPV)[15]、方波伏安法(SWV)[16],以及线性扫描伏安法(LSV)[17]等。

循环伏安法(CV)是最常用的电化学检测方法,其工作原理是根据研究的需要在设定的电极电势范围内变速扫描,促使阴阳两极发生氧化还原反应,得到电流-电压曲线,即循环伏安图,然后定性判断电极反应的性质,也可用于定量测定反应物浓度等参数。循环伏安法是考察新制电极功效时优先采用的方法,在黄酮类化合物的测定中,该方法主要用来研究化合物在电极表面的电化学响应信号以及电化学行为影响因素,如pH、扫描速率、富集电位和时间等。

差分脉冲伏安法(DPV)是指恒电位仪在阶梯扫描伏安法(SCV)和线性扫描伏安法(LSV)的基础上,叠加一系列的正、反向电压脉冲所衍生的一种电化学测量方法。不同浓度待测物在修饰电极上可呈现DPV响应变化关系,即DPV曲线,通过该曲线可以看出待测物在修饰电极上是否有更多的电子转移而呈现良好电化学响应,图3为不同浓度芦丁在N&P/LRPC-800-1/GCE修饰电极上的DPV曲线示意图[18],由图可以看出,随着浓度增大,峰值电流也增大直到电极表面芦丁的吸附达到饱和。通过DPV曲线可以进一步分析得出一定浓度范围内修饰电极对待测物的检出范围和最低检出限,物质含量即可通过标准曲线测量电流获取。相比循环伏安法,差分脉冲伏安法中杂质造成的氧化还原电流干扰低,从而使产生的背景电流小而平缓,表现出更高的分辨率和灵敏度,检测限更低。一般DPV法用作不同浓度及实际样品中黄酮类化合物含量的定量分析与测定,常与CV、SWV、LSV等方法联用,以提高检测灵敏度。

图3 不同浓度芦丁DPV曲线[18]Figure 3 DPV curves of different concentrations of rutin[18]

图4 介孔碳材料SBA-15制备示意图[25]Figure 4 Schematic diagram of the preparation of mesoporous carbon material SBA-15[25]

2 化学修饰电极在黄酮类化合物含量检测中的应用

化学修饰电极的界面性质和检测性能与电极修饰材料有关。通常选择比表面积大、导电性强、表面催化活性高、化学性质稳定的物质作为理想的修饰材料,从而起到增强吸附能力,提高催化性能,促进待测物在电极表面富集的作用。黄酮类化合物电化学分析常用的修饰材料主要包括碳材料、金属材料、无机功能性材料、金属有机框架材料、生物材料、离子液体材料及分子印迹膜等[19]。近年来使用上述不同材料制备化学修饰电极研究中药有效成分的研究多有报道[20-21],研究人员使用不同的电化学分析方法实现了对黄芩素、黄芩苷、槲皮素、芦丁、木犀草素、橙皮素等黄酮类化合物的检测,并证实了各类化合物峰电流值与浓度在一定范围内呈现较好的线性关系,且检测范围宽,检出限低,展现了不同修饰材料的性能与优势。

表1列出了常用典型修饰材料的种类及其构建的化学修饰电极对重要黄酮类化合物分子的检测性能。随着纳米复合材料研究的迅速发展,用来修饰电极的材料种类和组合方式越来越多,运用范围和途径越来越广,在黄酮类等中药有效成分检测领域展现出了良好的应用前景。

表1 不同类型化学修饰电极对黄酮类化合物的检测Table 1 Detection of flavonoids by different types of chemically modified electrodes

2.1 碳材料修饰电极

碳材料是应用最广泛的化学修饰电极材料之一,其在电化学检测领域的研究较多[46],主要有多孔碳材料、生物碳材料和碳纳米材料等。Ai Yijing等[22]研究人员以香蕉皮为原料合成了基于香蕉皮衍生的生物质碳和多壁碳纳米管复合材料的修饰电极BPBC-MWCNT/GCE,并进行了黄芩素的含量检测,突出了该类电极材料的优势及其在药物检测中的潜在应用。李可欣等[23]利用山梨酸钾(PS)制备了基于PSIPC-900材料的一种衍生的多孔碳修饰电化学传感器,通过橙皮素(HSP)的酚羟基及甲氧基结构和性质,考察了橙皮素在修饰电极上的电化学响应,最优条件下,橙皮素在该电极的检出限为2.10×10-8mol/L。刘耀鹏等[24]将废弃花生壳作为生物质材料,制备了一种基于PHAPC/GCE的电化学传感器,用于黄酮类化合物芦丁的检测,检出限低至5.00×10-8mol/L,相比其他生物碳材料传感器重复性更好。目前,生物质衍生多孔碳材料能通过引入官能团,掺杂金属、非金属元素提高电化学活性,改性后的碳结构活性位点与孔道结构更加丰富。多孔碳材料的多孔特性、大比表面积及优异的电化学性能为黄酮类化合物的检测提供新思路。

基于石墨烯、碳纳米管和富勒烯的碳纳米及其复合材料是当前化学修饰电极领域的研究热点。石墨烯(GR)是应用最广泛,发展潜力最好的碳纳米材料之一,石墨烯中的碳原子杂化类型为SP2,具有单原子层结构、高表面积和稳定的电化学性质,是良好的电化学传感材料。值得注意的是,石墨烯在溶液中的分散性能不好,单独作为电极修饰材料极易发生团聚现象[29],所以目前多用于制备石墨烯复合材料修饰电极。瞿万云等[26]通过制备Nb2O5-石墨烯(Nb2O5-RGO)纳米复合材料电化学传感器检测黄芩苷,证实了该修饰电极显著的电催化活性,对黄芩苷的检测线性范围宽,可用于实际样品黄芩颗粒中黄芩苷的含量测定。翟江丽等[27]制备石墨烯-纳米银(GR-AgNPs)复合材料修饰电极检测芦丁,通过与高效液相色谱法和紫外-可见分光光度计的测试结果比较,发现DPV法准确度高,加标回收试验进一步表明,芦丁实际样品芦丁药片和苦荞平均回收率达到98.9%～101.0%和99.4%～103.0%。这说明与裸玻碳电极和石墨烯修饰电极相比,该修饰电极导电性能更好,重现性和稳定性优良。王玉华等[28]制备了PMB-EGR复合材料修饰电极,该复合电极材料兼具石墨烯的高导电性和聚合物的高稳定性优点,在芦丁的检测中表现了高灵敏性和高催化性能。刘茜雅等[29]构建了分析葛根素的聚多巴胺-氧化石墨烯复合物修饰电极,以期通过多巴胺和石墨烯层层组装形成复合物,改善石墨烯在水溶液中的分散性,研究表明,该复合修饰材料具有良好的电化学响应。

碳纳米管可看作石墨烯片层卷曲而成,根据管壁数量一般可分为单壁、双壁和多壁纳米管,比表面积具有模量高、强度大、吸附性强、导电性好等特点,是一种新颖的电极修饰材料。大量研究表明,碳纳米管常与其他碳纳米材料、金属纳米材料组装,利用相互之间的协同作用,发挥更优异的电催化性能[47]。吴巧灵等[30]通过电化学还原法处理氧化石墨烯材料,制备了基于复合材料ErGO-MWCNTs的化学修饰电极,通过分析木犀草素在该电极上的电化学行为,发现碳纳米复合材料的组合电催化效能更强,可以有效发挥协同作用。李小蓉等[31]通过组装Nafion-多壁碳纳米管与贵金属纳米金材料,制备了用于芦丁检测的电化学修饰传感器,同时在重现性和稳定性实验中研究了未知物质(无机离子、有机物、生物分子等)对芦丁测定的影响,结果表明,该传感器抗干扰能力强,对芦丁电化学响应良好,可有效用于中药实际样品槐米中芦丁的检测。近年来,碳纳米材料修饰电极,特别是多种碳纳米材料的组合在构建电化学传感器中的应用,有效地提高了黄酮类化合物的检测灵敏度,极大地推动了碳材料修饰电极在中药成分分析领域的实用化进程。

2.2 金属纳米材料修饰电极

金属纳米包括贵金属纳米、过渡金属纳米和金属氧化物纳米等[31],其中贵金属纳米材料主要指纳米金、纳米银、纳米铂等纳米粒子,因这类材料导电性能好,性质稳定,应用最为广泛,这些材料除了具有纳米级量子尺寸,还携带大量自由电荷,具有独特的电化学性能。

纳米金粒子直径约1～100 nm,特点是比表面积大、光电效应独特、制备过程简单、生物相容性好[33],已经普遍作为化学修饰电极材料用于黄酮类化合物的检测。鲍昌昊等[32]开发了基于纳米金粒子(AuNPs)的碳纤维超微电极(AuNPs/CFME),并将其应用到儿茶素的检测中,研究表明,修饰电极对儿茶素具有明显的电催化效果,检出限低至6.63×10-10mol/L,且该传感器制备简单、成本低,适应于儿茶素的痕量分析。施敏等[33]制备了基于纳米金粒子(AuNPs)的碳纤维超微电化学传感器(AuNPs/CFME),建立了针对黄酮类化合物木犀草素的简单、高效检测新方法,并将其应用于实际样品含量测定,回收率达到94.0%～104.0%。金属纳米材料与碳纳米材料的协同作用有效推动了该化学修饰电极复合材料的广泛应用。李小蓉等[34]针对芦丁电化学传感器检测灵敏度和选择性问题,构建了GCE/MWNTs/Nafion/Au传感器,为芦丁含量测定提供了新方法。该方法在黄酮类化合物的质量控制中有广泛的应用前景。

2.3 无机功能性材料修饰电极

金属氧化物半导体纳米材料是常用的无机功能性材料,金属氧化物种类繁多、价格低廉、理论比电容高,制备成纳米材料后,比表面积增大,电子传递能力进一步增强,是一种良好的化学修饰电极材料。解丹萍等[35]用六水合硝酸锌和六亚甲基四胺合成了纳米氧化锌,制备了二氧化锰(MnO2)/纳米金(AuNPs)/氧化锌(ZnO)半导体电极,检测槲皮素线性范围是1.00×10-6～4.00×10-4mol/L,表明该电极选择性和灵敏度较好,对黄酮类化合物的检测有参考意义。

层状双金属氢氧化物,即水滑石类化合物(LDHs),是一类新型无机功能性材料,该材料的突出优势是化学组成可调,组成离子的种类和数量可调,组装体粒径可调。由于这类化合物特殊的层状结构及理化性质,在催化、离子交换和吸附、医药等方面得到广泛应用[48]。白小慧等[36]制备了Ni2+-Al3+-LDHs类水滑石并修饰到玻碳电极,得到Ni2+-Al3+-LDHs/GCE修饰电极检测槲皮素,电化学行为显示该电极对槲皮素的电催化性能良好,检出限为1.75×10-8mol/L,证实了类水滑石修饰电极可用于实际样品中槲皮素的痕量测定。

2.4 金属-有机框架材料修饰电极

金属-有机框架(MOFs)主要由金属离子或无机簇和有机配体构成,这类化合物因其内表面积大,孔隙率高,热稳定性好,结构可调等优异性能[37],作为一类新功能材料广受关注。Li Yuhong等[37]以多壁纳米管和CAU-1金属有机框架为电极修饰材料,将该材料修饰到玻碳电极表面,制备了MWCNT/CAU-1/GCEs电化学传感器用于芦丁的检测,定量分析结果表明,该电极线性范围较宽,检出限低,稳定性和准确性优异,适用于黄酮类化合物芦丁实际样品的检测。郑子祺等[38]为了提高葛根素电化学催化性能,采用电化学工作站中的恒电位电沉积技术i-t法(电流-时间曲线)将修饰材料MIL-88沉积到电极表面,制备了MIL-88/AGCE修饰电极用于葛根素的电化学检测,该化学修饰电极在实际样品药材葛根粉中的回收率为95.6%～100.0%。程昊等[39]针对MOF-5的应用局限性,尝试加入绿色碳源葡萄糖提高材料吸附性,成功制备了糖基MOF-5@介孔碳纳米纤维修饰电极(Glc-MOF-5/MCNFs/GCE),通过DPV法研究该修饰电极对木犀草素的电化学行为,相比其他电化学方法,木犀草素在该电极上的线性范围更宽(9.00×10-9～5.00×10-6mol/L),检出限较低(5.20×10-9mol/L),表明复合材料Glc-MOF-5/MCNFs有效增强了电极的电催化性能,灵敏度高,适用于实际样品分析。虽然金属-有机框架材料结构、功能多样,但其进一步实际应用受其粉末结晶状态局限,开发功能性良好的自支撑多孔复合材料是有效固定MOF粉末的方式,在合成新功能修饰电极研究方向上具有巨大潜力。

2.5 生物材料修饰电极

氨基酸、酶、DNA等生物材料因较强的生物活性,且能在玻碳电极表面形成致密、稳定的特异性有机薄膜[49],也常被应用于黄酮类化合物等天然药物分子的检测。例如,杨银等[40]选择内部结构性能优越的L-络氨酸为修饰材料制成聚L-络氨酸修饰电极,同时考察了黄酮类化合物槲皮素在电极上的电化学行为和测定最优条件,实验表明,该生物修饰电极重现性好,检测限低,有良好的电催化能力。Mattos等[41]制备了基于纳米粒子(PdNPs)/赤铁矿(α-Fe2O3)/多酚氧化酶的光电化学酶生物传感器检测芦丁,证实生物分析装置检测性能良好,操作简易。但是,生物材料修饰电极的电化学反应一般不可逆,重现性不好,同时存储成本高,因而其应用相对局限。

2.6 离子液体材料修饰电极

离子液体(ionic liquids)又称室温熔融盐、有机离子液体等,离子液体的阳离子是有机结构,大多数室温下为液体。离子液体化学性质稳定,导电性好、电化学窗口宽,黏度高,疏水性优异等[50],现常与其他材料结合构建复合型修饰电极或电化学传感器,应用于各类物质的检测分析。离子液体应用于化学修饰电极检测黄酮类化合物主要是通过制备聚离子液体疏水膜实现。瞿万云等[42]合成了含有吡咯环的离子液体,并以该离子液体为单体制备了聚离子液体疏水膜界面(修饰电极),制得PIL/GCE修饰电极用于槲皮素的检测,通过槲皮素在修饰电极上的电化学行为,证实了该电极良好的灵敏度、准确性和重现性。Mehmet等[43]报道了基于CoFe2O4纳米粒子的离子液体新型复合型电化学传感器用于芦丁的检测分析,线性范围和检测线分别为1.00×10-10～1.00×10-8mol/L,检出限为3.00×10-11mol/L,检测灵敏度较高。

2.7 分子印迹聚合物构建电化学传感器

基于分子印迹技术的分子印迹聚合物(MIPs)材料选择吸附性能优异[51],目前已作为化学电极修饰材料应用于黄酮类化合物的检测,刘蓉等[44]以邻氨基酚为功能单体,槲皮素为模板分子,选择增敏效果好的石墨烯(GR)和单壁碳纳米管(SWNTs)材料修饰到金电极表面,通过电聚合过程制备了分子印迹膜(MIP)电化学传感器(MIP/SWNTs/GR/Au)如图5,研究表明,该分子印迹传感器对槲皮素分子具有良好的稳定性和选择性,和其他方法比较,线性范围(3.00×10-7～1.92×10-5mol/L)较宽,检出限(1.00×10-7mol/L)较低,为黄酮类化合物及其实际样品测定提供了简便、快速、准确的方法。Bolu Sun等[45]以苯胺为单体,制备了基于纳米多孔碳的分子印迹聚合物电化学传感器(MIP/NC/GCE),该传感器检测毛蕊异黄酮性能优良。针对因聚合物的单一吸附所造成的天然产物浪费问题,楚善明等[52]选择了槲皮素和橙皮素的复合模板分子,合成了具有组选择性的分子印迹聚合物并研究了该材料对黄酮类化合物的吸附性能,证实了该MIPs吸附容量高,重现性好。

图5 MIP/SWNTs/GR/Au传感器制备示意图[44]Figure 5 Schematic diagram of MIP/SWNTs/GR/Au sensor preparation [44]

3 结论与展望

总体来说,化学修饰电极检测黄酮类化合物具有易操作、耗材少、前处理简单、响应速度快、可实现原位在线检测等优点,其检测灵敏度、准确度和选择性主要取决于黄酮类化合物的结构类型,电极修饰材料和修饰方法的选择以及电化学分析方法的合理运用。如表1所示,不同修饰材料构建的化学修饰电极对芦丁的检测范围和检出限均有差异,其中基于多酚氧化酶和离子液体的纳米复合材料检出限可以达到1.00×10-11mol/L[41,43],凸显了纳米复合材料修饰电极的高灵敏度;另外,同类型修饰材料对不同结构的黄酮类化合物检测性能也有差异[22-31],如同样都是碳材料修饰电极,介孔碳材料因其纳米棒状形貌和内部规整介孔孔道等优势,检测芦丁线性范围最宽,检出限达3.00×10-10mol/L。总之,不同的电极修饰材料虽具有其独特的电化学性能,同时也存在相应的局限性,因此,需针对结构不同黄酮类化合物合理选择修饰材料和修饰、检测方法,以进一步提高检测效率。

近年来,黄酮类化合物等植物多酚的抗氧化、抗癌研究一直是大健康领域的研究热点,建立精准、实用的快速检测及定量分析方法意义重大。化学修饰电极或传感器开发应用是电化学分析的前沿技术,随着纳米科技的发展,功能材料的合成、开发及组装,越来越多的新型多功能材料被应用到电极改良。探索合适的电极修饰材料和修饰方法,研究电化学方法与其他分离分析方法联用技术,不仅能有效提高电极对天然药效成分的检测灵敏度、准确度和选择性,还能加快相关研究成果在药材产地判定、纯度鉴定、假药识别等中药质量控制中的应用。随着人们健康意识、环保意识的增强,化学修饰电极在黄酮类等天然药物分子检测中的精准度和适用性研究必将得到更加快速的发展和应用。