腮腺多形性腺瘤和癌在多形性腺瘤组织中Kiss-1、MMP-9蛋白的表达

张 炜,柯少瑞,赵红宇,朱保玉

1)郑州大学第一附属医院颌面外科 郑州 450052 2)河南中医药大学协同创新中心 郑州 450046

多形性腺瘤(pleomorphic adenoma,PA)发病率占涎腺良性肿瘤的70%以上,全切术后有2%～3%的复发率,复发后癌变风险显著升高[1-2]。癌在多形性腺瘤(carcinoma in pleomorphic adenoma,CPA)占涎腺恶性肿瘤的15%～20%,由PA恶变所致,其手术预后比其他类型涎腺肿瘤差[3-4]。因此尽早发现及控制PA复发与恶变十分关键。

研究[5-6]表明抑癌基因Kiss-1在正常组织中广泛表达,但在转移肿瘤组织中表达下调或缺失,Kiss-1及其相关产物能够抑制肿瘤细胞浸润、趋化和转移。基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMP)是参与破坏基底膜蛋白酶中最重要的一类,其中MMP-9与细胞外基质的溶解及肿瘤的侵袭、转移密切相关[7]。本研究采用免疫组织化学技术检测正常腮腺、PA及CPA组织中Kiss-1与 MMP-9蛋白表达的变化,为进一步探讨CPA的发生机制提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象收集2018年7月至2021年9月在郑州大学第一附属医院手术切除并经病理确诊的正常腮腺标本 15 例,PA标本30 例, CPA标本45例;正常腮腺标本来源于腮腺区非肿瘤性疾病及外伤切除组织。所有病例临床资料完整,取材前无其他头颈部肿瘤史且无放化疗史,石蜡包埋组织完整。

1.2 主要试剂兔抗人Kiss-1 单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司,兔抗人MMP-9单克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司,免疫组织化学检测试剂盒、DAB显色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司,其余试剂购自中国医药上海化学试剂公司。

1.3 不同组织中Kiss-1和MMP-9蛋白表达的检测采用免疫组织化学染色法。取1.1中组织标本,4 μm厚连续切片,经体积分数100%、95%、80%、70%及50%乙醇梯度水化后进行热抗原修复,冷却至室温后用体积分数3%过氧化氢孵育5～10 min,PBS冲洗。滴加正常山羊血清以封闭非特异性抗原,滴加一抗(Kiss-1和MMP-9抗体质量浓度分别为1 000 mg/L和500 mg/L),4 ℃冰箱过夜,滴加二抗稀释液37 ℃反应15 min,PBS冲洗,加 SP反应15 min,DAB显色,苏木精轻度复染,脱水、透明、封片,拍照观察。以PBS代替一抗作为阴性对照。

Kiss-1和MMP-9蛋白阳性均为细胞质黄色或棕褐色颗粒状着色。选取10个高倍视野,每个视野均计数全部细胞。根据阳性细胞百分比和着色强度进行结果判定:阳性细胞百分比<5%计0分,5%～10%计1分,>10%～30%计2分,>30%计3分;不显色或显色不清计0分,淡黄色计1分,黄色/棕黄色计2分,褐色/棕褐色计3分;两项评分相乘,0～1分为阴性,2～6分为阳性。

1.4 肿瘤侵袭性判断主要根据CT和MRI检查,同时根据术中所见、内分泌学检查、术后病理学检查以及分子生物学行为等综合判断侵袭性[8]。

1.5 统计学处理采用SPSS 22.0处理数据。采用χ2检验或Fisher精确概率法比较正常腮腺、PA及CPA组织及不同临床病理特征的CPA组织中Kiss-1和MMP-9蛋白阳性表达率,用Spearman相关分析CPA组织中Kiss-1和MMP-9蛋白表达的相关性。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 不同组织中Kiss-1和MMP-9蛋白的表达正常腮腺、PA和CPA组织中Kiss-1蛋白阳性表达率逐渐降低,而MMP-9蛋白阳性表达率逐渐升高,见图1、表1。

表1 不同组织中Kiss-1和MMP-9蛋白的表达 例(%)

图1 不同组织中Kiss-1和MMP-9蛋白的表达(SP, ×400)

2.2 CPA组织中Kiss-1和MMP-9蛋白表达的相关性Spearman相关分析(表2)显示CPA组织中Kiss-1和MMP-9蛋白的表达呈负关联(rS=0.416,P=0.002)。

表2 CPA组织中Kiss-1和MMP-9蛋白表达的相关性 例

2.3 不同临床病理特征CPA患者Kiss-1、MMP-9蛋白表达的比较MMP-9蛋白表达与CPA患者的侵袭性、TNM分期有关。见表3。

表3 不同临床病理特征CPA患者Kiss-1、MMP-9蛋白表达的比较 例(%)

3 讨论

PA作为上皮源性的良性肿瘤,有别于一般良性肿瘤,表现出易复发、可恶变等交界性肿瘤的特点[1-2]。PA的发病和恶变机制尚未完全阐明,研究[8]认为侵袭性和转移性是PA发生、进展及恶变的主要原因之一。

Kiss-1基因是一种新的肿瘤转移抑制基因,在抑制肿瘤细胞的浸润性、运动性、化学趋向性和黏附性中具有重要作用,与肿瘤的侵袭转移密切相关;正常组织中Kiss-1基因表达水平较高,但在肿瘤组织或已发生转移的肿瘤组织中往往表达过低或缺失[5-6]。Singh等[9]研究发现发生淋巴结转移的卵巢癌组织中Kiss-1 mRNA表达降低。Li等[10]发现Kiss-1不仅与胃癌的发生有关,还与胃癌的侵袭、转移有关。本研究发现,和正常腮腺组织相比,PA和CPA组织中Kiss-1阳性表达率降低,且CPA组织中最低,表明Kiss-1表达缺失或下降在PA的发生与恶变中可能发挥一定的调控作用。

MMP-9以酶原形式造成基底膜缺失,在肿瘤的侵袭转移中发挥重要作用;胃癌组织中MMP-9表达显著增加,对肿瘤的发生、浸润转移有一定的促进作用[11]。本研究结果表明,MMP-9在正常腮腺、PA及CPA组织中表达逐渐升高,且MMP-9的表达与CPA的侵袭性、TNM分期有关,说明MMP-9在CPA的浸润、侵袭中起着重要作用。

研究[12]发现Kiss-1不仅能够通过影响核因子κB的转录进而降低MMP-9的表达,而且还可通过激活P38 MAPK激酶进而抑制MMP-9表达。另有研究[9-10]显示Kiss-1蛋白在卵巢癌和胃癌组织中表达降低,且Kiss-1与MMP-9的表达呈负关联。本研究结果显示,CPA组织中Kiss-1和MMP-9蛋白表达呈负关联,二者可能共同参与了CPA的发生、发展及转移。

综上所述,PA和CPA组织中Kiss-1蛋白表达减弱, MMP-9蛋白表达增强;Kiss-1、MMP-9蛋白可能与CPA的发生、发展及转移密切相关。PA组织中Kiss-1蛋白低表达、MMP-9蛋白高表达提示了其潜在恶性转化的可能。检测Kiss-1和MMP-9蛋白的表达变化可能为PA的临床治疗及预后评估提供一定的参考。