非常规前折叠素RPB5相互作用蛋白的生物学功能及其在肝癌中的研究进展

金龙飞，田彦璋

肝细胞癌是原发性肝癌最常见的肝癌类型，发病率占原发性肝癌的75%以上［1］，是最常见的恶性肿瘤之一，也是恶性肿瘤相关死亡最主要的原因之一，其发病率和死亡率分别位于所有恶性肿瘤的第5位和第3位［2］。目前研究表明在世界范围内，与行为危险因素相比，病毒危险因素对肝癌的影响更大，慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染占全世界所有肝细胞癌病例的44%，而21%的肝细胞癌病例可归因于丙型肝炎病毒（HCV）［3］。我国作为世界上HBV携带者较多的国家，已成为我国肝细胞癌病人最主要的致病原因。目前肝细胞癌病人治疗手段主要以肝切除术和肝移植治疗等预后效果较好，由于早期肝细胞癌症状无特异性，大部分病人就诊时已处于中晚期，从而错过最佳治疗时期，也是目前绝大多数肝细胞癌病人预后较差的原因之一。非常规前折叠素RPB5相互作用蛋白（the unconventional prefoldin，RPB5 interacting protein，URI）是不依赖腺苷三磷酸（ATP）的分子伴侣复合体，是前折叠素家族的一个大分子量成员，可以与其他小分子量前折叠素和RNA聚合酶第五亚基（RNA polymerase Ⅱsubunit B5，RPB5）形成复合体，通过参与调控细胞增殖、代谢、损伤应答、肿瘤致病等复杂的生物学过程并发挥重要的致病作用，越来越多的研究证实URI作为癌蛋白在肝细胞癌的发生、进展、转移及耐药等方面发挥重要作用，因此通过研究URI在肝细胞癌发生发展各过程中的作用机制，并为肝细胞癌病人的临床治疗提供新的手段是十分必要的。

1 URI的病理生理学作用

1.1 URI的结构与功能 最初URI基因是从人肝癌细胞HepG2互补DNA（cDNA）文库分离的，其编码蛋白称为URI， 2003年Gstaiger等［4］报道了1个URI蛋白，是不依赖ATP的分子伴侣前折叠素家族的非传统成员之一，能够使RPB5与乙肝病毒X蛋白结合从而调节RNA聚合酶Ⅱ的转录活性［5］，推测其与病毒性肝细胞癌的发生相关。

1.2 URI的表达和调控机制

1.2.1 URI在正常组织中的生理功能 URI能够促进基因转录、调控基因组稳定、调节细胞凋亡，对细胞周期、细胞骨架及细胞转录起到重要作用。URI在不同细胞室中发挥多种调节作用，在细胞核中，可与其他转录因子结合进行转录调控；在线粒体中，作为磷酸酶结合蛋白，促进相关信号通路的表达，实现正常的生理功能；在细胞质中，作为伴侣样蛋白，URI能够促进真核生物蛋白质稳态。URI作为伴侣蛋白前折叠素家族的一种分子伴侣，其表达受到各种环境因素的调节，它的主要生理功能可能是机体在面对有害的环境刺激时通过微环境稳态的调节，使得相关基因、组织免受伤害，最终避免病理性过程发生。

（1）URI在基因转录的调节中起作用：RNA聚合酶Ⅱ由包括RPB5在内的12个亚基组成，并通过与其他转录因子相互作用发挥作用。RPB5作为RNA聚合酶中唯一一个与DNA和染色质重塑因子接触的亚基和信号转导中转录调控的靶点，URI可以与其结合并调节转录的活性和稳定性［6-7］。（2）研究表明URI作为营养信号靶点，与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白依赖的营养调控代谢有关，可作为细胞调控的新途径［8］，通过调节一系列效应蛋白的活动协调控制细胞生长及增殖中发挥重要的作用。（3）URI在细胞凋亡中起作用：URI作为S6激酶1（ribosomal protein S6 Kinasebeta-1，S6K1）的线粒体底物，可以抑制结合酶的活性，降低了S6K1活性和促凋亡因子（BAD）磷酸化，从而改变了细胞凋亡的阈值［9］，诱导凋亡相关蛋白上调导致细胞的凋亡。

1.2.2 URI在肿瘤组织中的调控作用 （1）胃癌中，下调URI可诱导胃癌细胞产生明显的自嗜通量［10］，自嗜可以通过清除受损细胞器中的致癌或有毒蛋白来抑制肿瘤也可以通过自噬介导的细胞内循环底物促进肿瘤的发生［11］，同时URI的表达促进胃癌的发生及耐药性［12］；最近研究证实URI环状RNA能够直接与异质核核糖核蛋白M相互作用，调节基因选择性剪接，参与癌细胞的迁移过程［13］。（2）在卵巢癌中，URI编码蛋白磷酸酶1γ催化亚基（protein phosphatase 1 catalytic subunit gamma，PP1γ）和PP1γ介导的S6K1-BAD生存信号反馈抑制的线粒体抑制剂，是卵巢癌中扩增和过表达的致癌基因［14］。（3）在宫颈癌中，URI在癌前宫颈上皮内瘤变和浸润性宫颈癌中显著上调，且过表达URI显著促进细胞生长，而URI下调抑制细胞增殖［15］。（4）在非小细胞肺癌中，URI的表达与肿瘤组织的淋巴结状态和T分期有关，能够促进癌细胞的增殖，同时使肿瘤细胞具有抗化疗的放疗的能力［16］。（5）在食管癌中，URI过表达可促进肿瘤体内和体外生长，还可降低放疗易感性，这一结果为食管癌基因靶向治疗提供了有力的机会［17］。

2 URI在肝细胞癌发生发展中的调控作用

肝细胞癌的发生是肝细胞在各种致病因素条件下再修复过程中生物学特征逐渐变化的复杂过程，包括基因突变，增殖与凋亡、促癌基因与抑癌基因表达失衡。研究表明URI在肝细胞癌中通过不同的信号通路抑制内源性及外源性凋亡从而起到化疗抵抗作用，进而影响肝细胞癌细胞系的生长、凋亡［18］。最近有实验［19］发现URI表达可显著抑制SMMC-7721和HepG2中肝癌细胞的凋亡，并且在剔除URI后抑制肝癌细胞的增殖；URI显著抑制肝癌细胞克隆形成能力和降低或完全抑制肝癌细胞的体内成瘤能力。因此，URI的高表达和肝细胞癌病人的临床病理特点及预后相关肿瘤中的URI水平可以很好的用来评估肝癌病人的预后。

2.1 URI通过DNA损伤导致肝细胞癌发生 Tummala等［20］2014年阐明了一个新的途径，该途径将公认的致癌基因URI和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）池与基因毒性应激和肝细胞癌发生联系起来。Djouder［21］和Ana等［22］研究也证实URI抑制了与L-色氨酸/NAD+代谢相关的芳基烃和雌激素受体介导的酶转录，从而导致DNA损伤，并通过辅助性T细胞17和白细胞介素（IL）-17A引发炎症反应，导致肝细胞癌风险的发生。此外，代谢产物在肝癌的发生发展中发挥重要的作用［23］，临床相关代谢组学研究［24］发现在肝细胞癌病人门静脉血及肝癌组织中L-色氨酸水平明显高于癌旁非肿瘤组织及健康对照组，通过富集分析发现，L-色氨酸与苯丙氨酸和色氨酸代谢相关通路显著相关，而上述通路及其代谢产物也被报道参与全身炎症和肝细胞癌的发生。由此我们猜想由于烟酰胺在致癌保护、DNA修复及维持基因组稳定性方面的保护作用和其在癌症病人发展之间的联系，通过补充NAD+或减少URI表达或许可以降低肝细胞癌发生的风险，这一猜想还需进一步研究。作为传统抑癌基因，p53通过调控转录程序和细胞功能，维持基因组稳定性［25］，抑癌基因突变是癌症发生的因素之一，但研究发现，非突变型相关的P53失活机制在许多肝细胞癌病人中被发现［26］。此外，p53磷酸化、乙酰化及甲基化水平异常可导致P53功能丧失以及DNA损伤修复的能力下降进而加速了肝细胞癌的发生。

2.2 URI对细胞周期调控促进肝细胞癌发生 URI在有丝分裂和减数分裂细胞周期中具有重要的功能，而URI的缺失可表现为细胞周期阻滞的DNA断裂，此外URI降低激活了β-连环素（β-catenin）诱导的原癌基因c-myc的表达导致细胞DNA损伤。Yart等［27］基于URI与多效转录调节因子RNA聚合酶Ⅱ相关因子Ⅰ（Paf1）复合体相互作用，评估了Paf1是否影响细胞周期进程，结果发现S期细胞比例增加同时伴有G1期细胞的减少，目前Paf1被证实参与RNA聚合酶Ⅱ（RNA PolⅡ）转录周期的几乎所有阶段［28］，而且Paf1的降解导致组蛋白修饰积累下降［29］。这些结果均提示URI可能在组蛋白修复和细胞周期控制中发挥重要作用。

3 URI促进肝细胞癌发生发展的相关机制

3.1 URI在肝炎病毒感染相关性肝细胞癌中的作用 HBV、HCV或HBV/HCV双重感染可显著增加肝细胞癌的发展风险，目前所知乙型病毒X蛋白肝细胞癌的发生发展密切相关。HBV最小的基因（HBx）被认为是肝细胞癌发生过程中一个重要的病毒致癌基因，但病毒致癌作用的分子机制尚不完全清楚，而作为一种小调节蛋白及混杂转录反式激活因子，是HBV感染、复制、致癌作用相关的细胞基因激活的关键调控蛋白［30］。过表达URI加速了乙肝病毒X基因诱导的裸鼠移植瘤的生长，反之则促进了URI驱动的移植瘤的生长［31］。在一项研究中发现细胞凋亡蛋白抑制因子2在乙肝相关性肝癌组织中的表达与非乙肝型肝癌组织及乙肝型癌旁组织相比显著提高，并且与病人的临床分期、包膜侵犯、门脉侵袭、发生淋巴结转移有相关关系［32］。作为肝细胞癌发生三部曲，从病毒性肝炎、肝炎肝硬化到肝细胞癌的发生，URI与肝细胞纤维化的相关性及其与乙肝病毒X基因相关机制还在进一步研究当中，并对病毒性肝细胞癌的发生机制提供新的研究方向。

（1）乙肝病毒X基因可通过抑制S期激酶相关蛋白SCF（Skp2）泛素E3连接酶介导的Myc泛素化来稳定Myc癌蛋白［33］，并且使得c-myc与URI基因上游非规范区E-box稳定结合，进而增强URI基因的表达，并且乙肝病毒X基因介导的Myc稳定在很大程度上有助于病毒的肿瘤发生［34］。（2）在早发性乙肝病毒感染型肝细胞癌（HCC-B）中发现比晚发型更高的c-myc表达水平，而且早发型肝细胞癌的8q24区的HBV整合位点与c-myc、浆细胞瘤变异位1和微RNA-1204的表达密切相关［35］，目前这一整合位点在肝细胞癌发生或进展的作用机制还未完全阐明。（3）最近实验研究［36］表明，乙肝病毒X基因突变能够促进肝细胞癌的发生，将野生型与四种突变型乙肝病毒X基因注射入小鼠体内，其中C端截短X蛋白（CT-乙肝病毒X蛋白）突变型小鼠体内的纤溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）和细胞分裂周期因子20（CDC20）上调，并且显著增加HepG2和HeLa细胞的增殖和S期比例，诱导促癌炎症，促进癌变。此外，有相关研究表明PAI-1通过介导大肠癌［37］、非小细胞肺癌［38］中的上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）促进细胞的侵袭和转移。而另一项研究［39］也证实CT-乙肝病毒X蛋白通过调控硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP）调节肝癌细胞进展过程的有氧酵解促进肝细胞癌的发生。

3.2 URI通过代谢性疾病促进肝细胞癌的发生 2型糖尿病在肝细胞癌的发生发展中扮演着非常重要的角色，通过长期临床观察，肝细胞癌的发生、进展与糖尿病的病程有关，是肝癌发生发展中独立或协同的危险因素且全球约7%的病例可归因于糖尿病。在葡萄糖剥夺下，蛋白激酶A可通过磷酸化URI，进而抑制O-连接的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶（OGT），从而降低c-myc水平。而当葡萄糖丰富时，去磷酸化的URI通过激活OGT来稳定c-myc蛋白，从而促进c-myc依赖的肿瘤发生［40］。厦门大学研究学者［41］发现在早期肝脏肿瘤病灶及小肿瘤中普遍存在糖原过度积累现象，乙肝病毒X基因可通过促进脂肪酸氧化从而维持非酒精性脂肪性肝病（NADPH和ATP水平来保护肝细胞癌细胞免受葡萄糖剥夺引起的代谢压力的影响［42］。因此，代谢性疾病的某些发病机制与肝细胞癌发生、发展中的相关研究或许能够成为一种新的研究思路，包括代谢组学、肠道菌群等相关研究在临床也更易开展，为我们对研究肝细胞癌的发病原因及机制提供更多可能性。

3.3 URI通过相关分子信号通路促进肝细胞癌的发生 （1）Notch信号通路在许多癌症的发生发展中扮演着重要的角色。Notch信号通路通过促进肝细胞增殖抑制其凋亡、调控细胞周期及EMT等多种机制来调节肝癌的发生发展［43］。URI通过与IL-6的转录因子P65及RPB5的相互作用上调IL-6的转录水平，而IL-6作为恶性肿瘤自分泌和旁分泌的促进因素，在转移能力和侵袭性更高的组织中检测到更高表达量的IL-6，并且上调肿瘤中肿瘤干细胞数量，同时也促进了EMT的发生［44］。（2）Wnt/β-catenin信号通路是肝细胞癌发生的重要驱动力，在HCC-B中CTNNB1基因的突变频率比非HBV相关性肝细胞癌低得多［45］，而乙肝病毒X蛋白可以激活Wnt/β-catenin信号转导促进肝细胞癌的进展［46］。已有研究证实URI可通过心脏成纤维细胞中的非编码RNA参与Wnt/β-catenin信号的激活［47］。而且URI可通过过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子（PGC-1）依赖机制维持心肌细胞线粒体功能，进而对心肌细胞起到保护作用［48］。因此可推测乙肝病毒X基因和URI在HCC-B中Wnt/β-catenin信号的激活中发挥一定作用，这种作用机制还需进一步深入探究。HBV能够诱导酪氨酸激酶磷酸化，导致HBV转录复制以及β-catenin信号通路的激活，但与之前研究相反的是本研究确定了HBV、增加酪氨酸激酶活性、黏附连接不稳定和增强β-catenin信号之间的联系，发现酪氨酸的激活不需要转录激活剂乙肝病毒X基因［49］，这一结果为HBV-宿主细胞相互作用提供了新的见解，并有助于理解HBV相关致癌的分子基础，同时也提供了潜在的针对HBV的新治疗方法。（3）肝细胞癌常由慢性肝炎和慢性肝硬化发展而来。在此过程中，核因子κB （NF-κB）是一种重要的转录因子，大量炎性因子使NF-κB信号通路异常激活。其调控与多种细胞功能相关的基因，如细胞增殖、生存发展、血管生成和癌症转移，研究人员证实，泛素化和磷酸化介导的信号转导对NF-κB信号通路［50］激活具有重要的控制作用；其中p50和p65亚基是占主导地位的细胞NF-κB的异源二聚体，通常被隔离在未受刺激的细胞的细胞质中，一旦细胞暴露于细胞外刺激，p65亚基被磷酸化，就会转移到细胞核中，从而激活NF-κB信号通路。因此，NF-κB p65/p50复合物的胞质积累被认为是终止NF-κB信号通路［51］键机制。此外， EMT作为肝细胞癌病人转移和预后不良的重要危险因素，被证实URI通过NF-κB信号通路促进肝细胞癌细胞EMT的发生［52］。

4 URI在肝细胞癌诊断和治疗中的作用及未来展望

4.1 URI的磷酸化作用 蛋白的翻译后修饰在细胞信号转导中起到重要作用，也是肿瘤发生的重要环节，蛋白质作为基因功能的执行者，在蛋白磷酸化水平实现对肝细胞癌的早期诊断是十分必要的。在肿瘤的发生发展过程中，基因的变化与蛋白的变化水平并不完全同步，而磷酸化作用作为蛋白组与磷酸化蛋白组的研究进一步理解癌症发生的相关机制。相关研究中发现在肝癌细胞中观察到各种蛋白异常磷酸化，包括激酶、磷酸酶、转录因子等，而这些蛋白的磷酸化可能是导致肿瘤发生和决定肝细胞癌进展的必要因素。URI含有潜在的磷酸化位点，而这些位点具体生物学功能还需进一步研究，URI能通过磷酸化核因子RelA/p65及毛细血管扩张性共济失调突变蛋白（ataxia telangiectasia mutated protein，ATM）激活NF-kB信号通路从而抑制肝癌细胞内源性凋亡。URI促进p65的磷酸化，活化的P65迅速地从细胞质转移到细胞核内激活NF-kB信号通路，从而促进肝细胞癌的发生；URI可促进ATM磷酸化，上调抗凋亡蛋白Bcl-xL的表达实现抗凋亡作用。因此，促进或者阻断URI的磷酸酶活性以及其作为磷酸酶结合蛋白被磷酸化作用，明确蛋白磷酸化位点为我们对肝癌药物研制提供新的靶点，同时也实现了对肿瘤进行的分子谱系统描述，并根据分子特征谱，进行肿瘤的精准分类及诊疗研究，通过蛋白组及磷酸化修饰蛋白组差异分析等蛋白质组学技术，进行一系列相关模型构建得出相关癌症的诊断及预后对我们研究癌症的机制可能会提供有更多的帮助。

4.2 URI对肝细胞癌耐药性的研究 系统化疗已成为除手术切除外肝细胞癌治疗最主要的方法，然而，目前治疗肝癌的各种化疗药均表现出较强的化疗耐药性，很大程度妨碍了药物治疗的选择［53］。URI作为分子伴侣，它的主要生理功能调节微环境稳态，当基因受到外界环境干扰时，可保护基因应激诱导突变而存活下来，肿瘤在进行化疗过程中会导致DNA损伤，并增加基因突变概率，最终导致部分肿瘤细胞被筛选出来进化出耐药性。澳大利亚学者［54］发现，在药物筛选环境下，mTOR信号通路能使高精度的DNA损伤修复途径被抑制，并导致基因突变频率增加，从而使得肿瘤获得耐药性的概率大大增加。文章作者也提出猜想基因突变其实相当于一把“双刃剑”，在适宜环境中，这些基因突变是有害的，而在不利的环境下，基因突变的产生会增强肿瘤的抗逆性，导致肿瘤化疗抵抗，并提出利用合成致死效应去杀死耐药肿瘤的策略。在人类癌细胞中，由于自噬具有自我保护或凋亡的双重作用，激活自噬可作为一种促进生存的肿瘤反应，有助于治疗耐药性，研究［55］证实URI通过促进AMP活化蛋白激酶的活性来激活自噬，同时mTOR作为自噬诱导的重要调控因子，通过激活 mTOR可抑制自噬，而抑制mTOR活性则可促进自噬，通过这一特性或许能达到诱导肝癌细胞的凋亡的目的。综上所述， URI与mTOR的作用机制为进一步研究抗肿瘤治疗及肿瘤相关耐药性提供了可能的研究方向。

同时URI的耐药性在其他肿瘤中也有研究，在宫颈癌中，URI过表达增强了宫颈癌细胞对顺铂的耐药性［56］；在胃癌中，URI的过表达增强了胃癌细胞对阿霉素的耐药性；在胰腺导管细胞癌中伴随cmyc的表达下调，使癌细胞对索拉菲尼的敏感性增强［57］。在肝细胞癌中，c-myc能够诱导URI的表达，并增强URI稳定性，促进肝细胞癌细胞的增殖，而作为治疗肝癌病人中晚期的分子靶向药物，c-myc在肝癌中对索拉菲尼的敏感性及URI是否参与肝细胞癌耐药性还需进一步深入研究，为URI对肝癌病人的耐药性提供新的耐药机制研究靶点。

4.3 URI在肝细胞癌免疫抑制治疗方面的可行性 肿瘤细胞通过随机突变与自然选择表现出抗原水平下降、抗原缺失或抗原类型改变，并释放多种免疫抑制因子，形成免疫抑制微环境，从而实现免疫逃逸。近年来，随着肿瘤免疫治疗临床试验广泛开展，目前针对中晚期肝癌病人的免疫治疗已成为研究热点而且取得一定的临床效果，而近年来，有学者研究发现URI通过激活NF-kB及丝裂原活化蛋白激酶信号通路负性调控巨噬细胞功能［58］，p53基因作为免疫疗法的研究基因被证实，URI则可通过抑制p53的转录和表达抑制肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导的外源性细胞凋亡。麻省总医院［59］研究发现与免疫检查点阻断结合时，p53 mRNA纳米颗粒不仅能诱导对肿瘤生长的抑制，还能明显增加实验室肝细胞癌模型的抗肿瘤免疫反应。基于URI与p53在肝细胞癌中的致癌作用机制，这也为URI作为肝细胞癌免疫治疗提供新的研究思路，使URI作为一种新的免疫治疗方式成为可能。

综上所述，URI病理生理作用的进一步揭示，不仅对理解体内的多种生物学过程意义重大，更为相关疾病治疗靶点的开发提供了新的研究方向。而在肝细胞癌的发生发展过程中，URI通过各种病因（肝炎病毒、代谢性疾病、相关分子信号通路）参与肝细胞癌的发生，并对肝癌细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移、肝纤维化活性和血管生成等发挥着复杂的调控作用，由此可见，URI值得我们深入研究和探讨。但由于其分布广泛，并通过相关机制与其他分子发挥生理病理学功能，促进机体的生物学行为，调控各项生命活动，而目前URI在肝癌中的致病机制的相关研究及认识还不够深入，所以仍需要我们注重研究其靶向性，从而更精准地为与URI相关疾病的防治提供有效的干预靶点。