达格列净通过Rffl 抑制STAT1/TGF-β1信号通路改善糖尿病肾病肾小管上皮细胞EMT和纤维化

徐 洋，王 敏，张恒璐，周 莉，陆卫平

南京医科大学附属淮安第一医院内分泌科，江苏 淮安 223300

糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，是终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）发生的主要原因［1］。DKD的病理特征是肾小球硬化、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）合成增加、肾小管萎缩和肾小管间质纤维化［2］。越来越多的研究表明肾小管上皮细胞的上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）及纤维化在DKD 的进展中起重要作用，然而目前DKD 的治疗仍以控制血糖、血压、调节血脂为主要治疗原则，在抗纤维化方面效果并不明显［3］。

达格列净是一种钠-葡萄糖协同转运蛋白2（sodium-glucose transporter 2，SGLT-2）抑制剂，可以抑制葡萄糖的重吸收，促进尿糖排出，降低血糖。近年来研究发现，达格列净还具有肾脏保护作用［4］，然而其具体机制尚未明确。转化生长因子-β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）是作用最强的致纤维化细胞因子，通过介导多种信号参与肾纤维化的发生发展［5］。信号转导与转录激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）是STAT 转录因子家族成员，与高糖诱导的氧化应激、TGF-β1的表达以及ECM蛋白Ⅳ型胶原蛋白和纤连蛋白（Fibronectin）的产生有关［6］。泛素蛋白酶体系统是细胞内蛋白质降解的主要途径，可以严格调控TGF-β超家族信号转导。Rffl 是一种能抑制内体再循环的E3 泛素连接酶，可通过调控PRR5L 降解促进mTORC2介导的PKC-δ磷酸化从而延缓肺纤维化进展［7］。然而Rffl 在肾纤维化中的作用还未见报道。设想达格列净的肾保护机制可能与上调Rffl的表达抑制STAT1/TGF-β1通路相关。

本研究通过高糖培养肾小管上皮细胞模拟糖尿病肾病环境，探讨达格列净是否通过上调Rffl 的表达抑制STAT1/TGF-β1信号通路从而改善DKD肾小管上皮细胞的EMT和纤维化，为DKD的治疗提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

人肾小管上皮细胞HK-2 细胞（上海中乔新舟公司）；胎牛血清、DMEM 高糖培养基（含有4.5 g/L D-葡萄糖）、DMEM 低糖培养基（含有1 g/L D-葡萄糖）、0.25%胰蛋白酶、链霉素、青霉素（Gibco 公司，美国）；达格列净（Med Chem Express公司，美国）；鼠抗上皮细胞钙黏蛋白（epithelial cadherin，E-cadherin）、纤连蛋白（Fibronectin）、STAT1、α-Tubulin 单克隆抗体，兔抗α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、TGF-β1、Rffl多克隆抗体、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗（Proteintech公司，美国）；Trizol、质粒转染试剂LipofectamineTM2000脂质体（Invitrogen公司，美国），RT-PCR试剂（南京诺唯赞公司），RT-PCR引物（南京金斯瑞公司）；大肠杆菌DH5α（北京擎科生物科技有限公司）；空载质粒PCDH和重组PCDHRffl 质粒（广州易锦生物技术有限公司）；PCR 仪（Eppendorf公司，德国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

人肾小管上皮细胞HK-2在37 ℃、5%CO2的培养箱中用含有10%胎牛血清、1%青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 μg/mL）的DMEM 培养基培养。细胞生长融合至80%时，用0.25%的胰酶消化细胞，细胞收缩变圆后加入完全培养基终止消化，传代。传代后的细胞在37 ℃、5%CO2的培养箱中培养24 h 后换液1 次，以去除死亡的细胞，以后每2 d 换液1 次。取对数生长期的细胞用于实验研究。

1.2.2 分组

收集对数期HK-2 细胞，使用含4.5 g/L 葡萄糖的DMEM高糖培养基培养48 h，记作高糖组（HG组）；使用含有1 g/L 葡萄糖的DMEM 低糖培养基培养48 h，记作对照组（NC 组）。收集对数期HK-2 细胞接种于6 孔板，分为低剂量达格列净+高糖组（Dap-L组，使用含有5 μmol/L 达格列净的DMEM 高糖培养基培养48 h），高剂量达格列净+高糖组（Dap-H 组，使用含有10 μmol/L 达格列净的DMEM 高糖培养基培养48 h），PCDH 组（PCDH 转至HK-2 细胞，使用DMEM高糖培养基培养48 h），PCDH-Rffl组（PCDHRffl转至HK-2细胞，DMEM高糖培养基培养48 h）。

1.2.3 Western blot检测

取按照上述分组培养48 h的各组细胞，加入适量的RIPA 细胞裂解液提取细胞中的蛋白，BCA 试剂盒对蛋白进行定量，蛋白样品与上样缓冲液按照1∶5的比例充分混匀，100 ℃煮沸变性10 min，每个样品取50 μg进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，90 V 低温电转移2 h，5%的脱脂奶粉37 ℃封闭1 h，分别加入E-cadherin、α-SMA、Fibronectin、Rffl、TGF-β1、α-Tubulin 抗体，所有抗体均按照说明书稀释，4 ℃过夜，TBST 洗涤，分别加入1∶5 000 稀释的HRP 标记的羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG，室温孵育1 h，暗室内曝光显影，应用Image J软件分析各条带灰度值。

1.2.4 RT-PCR检测

采用TRIzol 法提取细胞中总RNA，参照反转录试剂盒合成cDNA。以cDNA 为模板进行qRT-PCR反应，PCR 循环条件：95 ℃30 s 预变性；95 ℃10 s，60 ℃30 s 共40 个循环；95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s 采集熔解曲线。以β肌动蛋白（β-actin）为内参，采用2-ΔΔCt法计算Rffl mRNA的相对表达量。

1.3 统计学方法

所有实验数据采用SPSS 21.0软件进行分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（）表示，两组比较采用t检验，多组间差异比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Rffl在高糖培养的HK-2细胞中低表达

qRT-PCR 检测了低糖和高糖培养的HK-2 细胞Rffl 的表达水平，结果显示HG 组细胞中Rffl mRNA水平较NC组明显降低。Western blot检测结果证明HG 组细胞中Rffl 蛋白表达较NC 组明显下调，差异有统计学意义（P＜0.05，图1）。

图1 不同浓度葡萄糖培养的HK-2中Rffl的表达水平Figure 1 Rffl expression level in HK-2 cultured at different glucose concentrations

2.2 在高糖培养的HK-2细胞中过表达Rffl

qRT-PCR 结果显示，转染重组质粒PCDH-Rffl后，HK-2 中Rffl 的表达水平与PCDH 组相比明显上升。Western blot 结果与qPCR 结果一致，表明成功构建过表达Rffl的HK-2细胞（P＜0.05，图2）。

图2 重组质粒PCDH-Rffl 转染后Rffl 在HK-2 中的表达水平Figure 2 Expression level of Rffl in HK-2 after transfected with recombinant plasmid PCDH-Rffl

2.3 过表达Rffl抑制高糖环境中HK-2细胞的EMT和纤维化

与NC 组相比，HG 组细胞中E-cadherin 蛋白表达水平降低，Fibronectin、α-SMA蛋白表达水平升高（P＜0.05，n=3）；与PCDH组相比，PCDH-Rffl组细胞中E-cadherin 蛋白表达水平升高，Fibronectin、α-SMA 蛋白表达水平降低（P＜0.05，n=3，图3），提示过表达Rffl抑制高糖环境中HK-2的EMT和纤维化。

图3 Western blot检测过表达Rffl对HK-2中E-cadherin、Fibronectin、α-SMA表达的影响Figure 3 The effects of Rffl overexpression on the expression of E-cadherin，Fibronectin and α-SMA in HK-2 detected by Western blot

2.4 达格列净抑制高糖处理的HK-2 细胞的EMT和纤维化

与NC 组相比，HG 组细胞中E-cadherin 蛋白表达水平降低，Fibronectin、α-SMA蛋白表达水平升高（P＜0.05，n=3）；与HG组相比，Dap-L组及Dap-H组细胞中E-cadherin 表达水平均升高，Fibronectin、α-SMA 表达均降低（P＜0.05，n=3）；与Dap-L 组相比，Dap-H组细胞中E-cadherin表达水平升高，Fibronectin、α-SMA表达均降低（P＜0.05，n=3，图4），提示达格列净抑制高糖处理的HK-2 的EMT 和纤维化，且达格列净的浓度越高，抑制作用越强。

图4 Western blot检测达格列净对HK-2中E-cadherin、Fibronectin、α-SMA表达的影响Figure 4 The effects of dapagliflozin on the expression of E-cadherin，Fibronectin and α-SMA in HK-2 detected by Western blot

2.5 达格列净促进高糖培养的HK-2细胞中Rffl 的表达

与NC组相比，HG组细胞中Rffl蛋白表达水平降低（P＜0.05，n=3）；Dap-L组及Dap-H组细胞中Rffl表达均高于HG组（P＜0.05，n=3）；与Dap-L组相比，Dap-H组细胞中Rffl表达水平升高（P＜0.05，n=3，图5），提示达格列净促进高糖培养的HK-2中Rffl的表达，且达格列净的浓度越高，促Rffl表达的作用越明显。

图5 Western blot检测达格列净对HK-2中Rffl表达的影响Figure 5 The effect of dapagliflozin on Rffl expression in HK-2 detected by Western blot

2.6 过表达Rffl 抑制高糖培养的HK-2 细胞中STAT1、TGF-β1的表达

相对于NC 组，HG 组细胞中STAT1、TGF-β1 的表达水平升高（P＜0.05，n=3）；与PCDH 组相比，PCDH-Rffl 组细胞中STAT1、TGF-β1 蛋白表达水平均降低（P＜0.05，n=3，图6），提示过表达Rffl抑制高糖培养的HK-2中STAT1、TGF-β1的表达。

图6 Western blot检测过表达Rffl对HK-2中STAT1、TGF-β1表达的影响Figure 6 The effects of Rffl overexpression on the expression of STAT1 and TGF-β1 in HK-2 detected by Western blot

2.7 达格列净抑制高糖培养的HK-2 细胞中STAT1、TGF-β1的表达

与NC 组相比，HG 组细胞中STAT1、TGF-β1 的表达水平升高（P＜0.05，n=3）；相比HG组，Dap-L组及Dap-H组细胞中STAT1、TGF-β1表达均降低（P＜0.05，n=3）；与Dap-L 组相比，Dap-H 组细胞中STAT1、TGF-β1表达均降低（P＜0.05，n=3，图7），提示达格列净抑制高糖培养的HK-2中STAT1、TGF-β1的表达，达格列净的浓度越高，抑制作用越显著。

图7 Western blot检测达格列净对HK-2中STAT1、TGF-β1表达的影响Figure 7 The effects of dapagliflozin on STAT1 and TGF-β1 expression in HK-2 detected by Western blot

3 讨论

糖尿病是世界范围内日益严重的公共卫生疾病，在全球普通人群中的患病率约为10%。根据国际糖尿病联合会的数据，到2035 年，全球糖尿病患者的数量将从2013年的3.82亿增加到5.92亿，其中大约40%的糖尿病患者会发展为DKD［8］。DKD 是糖尿病最严重的微血管并发症之一，是导致ESRD的主要因素，显著增加了糖尿病患者的病死率。肾小管上皮细胞EMT 及肾纤维化是DKD 进展到ESRD 的主要病理基础和共同途径，然而目前针对DKD的治疗方式在抑制EMT、抗纤维化方面效果有限。如何有效抑制肾小管上皮细胞EMT 及肾纤维化，从而阻止和延缓DKD 向终末期肾病发展，是目前亟待解决的难题。

肾小管上皮细胞EMT 在肾脏纤维化中发挥重要作用［9-10］，而抑制EMT 可以在一定程度上延缓肾纤维化进展。在EMT 过程中，上皮细胞的迁移、侵袭、抗凋亡能力增强，促进细胞外基质沉积，加剧肾间质细胞纤维化，严重危害肾脏功能［11］。E-cadherin作为细胞黏附连接的中心成分，是维持上皮细胞完整性所必需的。α-SMA是肌纤维成熟细胞表达的一个特征蛋白，在肾组织中可直接反映纤维化程度［12］。Fibronectin 是肾纤维化中一种主要的ECM 成分，其合成增加会促进ECM积聚，加快肾间质纤维化的进展［13］。肾EMT常以E-cadherin表达量降低，α-SMA、Fibronectin 等间质标志物表达量升高等为主要特征［14-16］。泛素化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰，它是泛素分子在一系列酶的作用下，与靶蛋白质共价结合的修饰过程。E3 泛素连接酶MARCH7能够调控E-cadherin 和β-catenin的表达。在卵巢癌中，USP7通过逆转MARCH7自身的泛素化，并稳定MARCH7，从而介导E-cadherin 和β-catenin 的表达［17］。TGF-β可以诱导EMT发生，在乳腺上皮细胞中，野生型p53可以调控TGF-β信号产生的EMT［18］，而E3 泛素连接酶Rffl 可通过使MDM2 变得稳定来促进p53的降解［19］。Rffl 还可通过PRR5L降解促进mTORC2介导的PKC-δ磷酸化从而影响肺纤维化进展［7］。本研究结果显示，高糖处理后肾小管上皮细胞中E-cadherin 表达水平降低，Fibronectin、α-SMA表达水平升高，而Rffl 过表达可逆转高糖诱导的肾小管上皮细胞EMT，提示Rffl 高表达具有一定的抑制高糖处理的肾小管上皮细胞HK-2发生纤维化的作用。

SGLT-2 抑制剂是一种不依赖胰岛素水平的新型降糖药，除降糖作用外，它还具备降低血压、改善肾小球高滤过、减少蛋白尿、改善氧化应激、抑制炎症等肾脏保护作用［20-21］。对18周的单侧肾切除db/db小鼠进行4 周达格列净治疗，肾脏TGF-β1、纤溶酶原激活物抑制物1、Ⅳ型胶原以及Fibronectin的表达均显著降低［22］。研究表明，达格列净可以通过抑制高糖毒性，进而降低O-GlcNAc糖基化修饰和减少肾小管缺氧［23］或抑制STAT1/TGF-β1通路激活［24］，从而改善肾小管间质纤维化。本研究结果显示，与高糖组相比，低剂量达格列净+高糖组及高剂量达格列净+高糖组中E-cadherin 表达水平均升高，Fibronectin、α-SMA表达水平均降低，并呈现出一定的剂量依赖性，提示达格列净具有抑制高糖处理的肾小管上皮细胞HK-2发生纤维化的作用。

TGF-β1在EMT 和组织纤维化中起重要调节作用，可以正向调控EMT，是肾间质纤维化及肾小球硬化的重要细胞因子［25］。高血糖会诱导激活DKD中STAT1和TGF-β1，并参与肾小管间质纤维化的过程［24］。抑制STAT1可以抑制肝纤维化的进展［26］，此外，STAT信号通路在肾纤维化中起着至关重要的作用，激活STAT 可诱导EMT 并导致肾损害缓解［27］。本研究表明，高糖处理后肾小管上皮细胞中STAT1、TGF-β1的表达水平升高，过表达Rffl后STAT1、TGF-β1表达水平降低，这表明在肾小管上皮细胞HK-2中E3泛素连接酶Rffl对STAT1/TGF-β1通路具有一定的抑制作用。此外，本研究发现达格列净同样可逆转STAT1、TGF-β1 的表达水平，并呈现出一定的剂量依赖性，这表明达格列净改善EMT的作用可能与抑制高血糖诱导的STAT1/TGF-β1通路相关。

本研究发现，达格列净可缓解高血糖条件下肾小管上皮细胞EMT和纤维化，并抑制了促纤维化因子STAT1和TGF-β1的表达。本研究初步探索达格列净对DKD 肾小管上皮细胞EMT 和纤维化的改善作用及其可能机制，但详细作用机制有待进一步深入探究。