4-羟基水杨酰苯胺对T淋巴细胞白血病肿瘤增殖与凋亡的影响

邓 惠，陈格格，徐 莉，贾新颜，施菊妹，4*

1安徽医科大学上海临床学院，上海 200072；2上海市东方医院血液科，上海 200120；3安徽医科大学第五临床医学院，安徽合肥 230032；4同济大学附属上海第十人民医院血液科，上海 200072

急性淋巴细胞白血病是一种侵袭性肿瘤，包括急性B 淋巴细胞白血病和急性T 淋巴细胞白血病。虽然T 淋巴细胞白血病5 年生存率超过85%，但疾病复发率与死亡率仍非常高［1-2］。目前迫切需要开发多药化疗的药物谱，针对性地杀伤肿瘤细胞，提高治疗效果。对于T淋巴细胞白血病或其他恶性肿瘤，细胞异常增殖是常见的特征［3-4］。在特定的细胞类型中干扰这一过程可能会提供潜在的治疗方法。在细胞增殖过程中，DNA损伤修复是细胞正常运行的保证。因此，DNA损伤修复异常成为恶性肿瘤转化的关键。无数新药通过阻断DNA损伤修复来干扰异常增殖，从而在抗肿瘤方面取得了惊人效果［5-7］。

在DNA复制和损伤修复的过程中，核糖核苷酸还原酶（ribonucleic reductase，RNR）是催化核糖核苷二磷酸合成脱氧核糖核苷酸的关键酶［8-9］。RNR的上调和激活，可导致肾上腺皮质癌、乳腺癌、子宫内膜癌、胶质母细胞瘤、肝细胞癌等恶性肿瘤的发生，提示RNR可能是肿瘤治疗的潜在靶点［10-13］。基于RNR 的抗癌药物或小分子药物有吉西他滨、氯法拉滨、羟基脲、曲平等［14-16］。而4-羟基水杨酰苯胺（4-hydroxysalicylaniline，HDS）已被证明，可通过与酶活性位点的竞争结合而抑制RNR酶活性，这也提示HDS 可能是一种治疗某些癌症的潜在药物［14，17］。事实上，HDS 已被用于治疗多种肿瘤，如肝细胞癌和多发性骨髓瘤［14］。但HDS在T淋巴细胞白血病中的作用及其机制尚不清楚。

鉴于HDS 的临床优势及其通过抑制细胞增殖对多种癌症的疗效，本研究在体内外实验中观察了HDS 对T 淋巴细胞白血病的疗效，为开发HDS 作为潜在的抗T淋巴细胞白血病药物提供了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

人源细胞株Jurkat、Hut-78细胞购自美国ATCC（American Type Culture Collection）。HDS 由上海中科院药物所惠赠，用二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）配成40 mmol/L 的溶液储存于-20 ℃备用。5 周龄雄性BALB/c 裸鼠购自江苏华创信诺医药科技有限公司。培养基RPMI-1640、DMSO（Gibco公司，美国），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，Hyclone 公司，美国）；一抗Cdc25A、CyclinA2、CDK2、GAPDH、Bad、Bax、Bcl-XL、Bcl-2、γ-H2AX、CHK1、p-CHK1、CHK2、p-CHK2、Ki-67抗体，HRP标记的二抗，R488 标记的荧光二抗（Abcam 公司，美国）；PI/RNase细胞周期染色液和Annexin-V-FITC/PI试剂盒、流式细胞分析仪（BD 公司，美国）；Synergy H4多功能酶标仪（BioTek公司，美国）；Leica正置荧光显微镜、Zeiss LSM710共聚焦显微镜（Leica 公司，德国）。本研究经过同济大学附属上海第十人民医院伦理委员会审查批准［SYXK（沪）2021-0012］。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

Jurkat 和Hut-78 细胞用含10% FBS 和1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基培养，置于37 ℃、含5%CO2的培养箱中，每2～3 d更换1次细胞培养液，以维持细胞培养所需条件。

1.2.2 细胞CCK-8实验

取处于对数生长期的Jurkat 和Hut-78 细胞，以2×105～3×105个/mL的密度接种于96孔板，HDS按梯度稀释后加入对应96孔板中，在恒温培养箱中培养24、48、72 h 后，于检测前2 h 向每孔加入10 μL 的CCK-8 试剂，继续避光放入37 ℃恒温培养箱孵育，酶标仪波长在450 nm下测量每孔吸光度值，计算细胞存活率，用CalcuSyn软件计算HDS对细胞的半数致死量（IC50）。

1.2.3 软琼脂糖克隆形成实验

配制3.5%和1.66%琼脂糖液，高压灭菌后置于42 ℃水浴锅备用；配制含20%血清的RPMI-1640 培养液备用；将3.5%的琼脂糖液和20%的RPMI-1640培养液按1∶5 比例混合，在12 孔板中制备下层胶（每孔1 mL）；收集对数生长期的Jurkat 和Hut-78 细胞，配制密度为4×103～5×103个/mL 细胞悬液，根据浓度加入相应体积的HDS母液；将1.66%琼脂糖与细胞悬液按1∶5的比例混合配制上层胶（每孔700 μL），室温凝固后将12 孔板置于培养箱中，每5～7 d 补充1 次培养液，集落形成后每孔加入0.005%的龙胆紫染液1 mL，室温避光染色1 h后吸走残余染液，拍照并计算克隆形成数。

1.2.4 细胞周期检测

收集对数生长期的Jurkat 和Hut-78 细胞，配成密度为2×105～3×105个/mL的细胞悬液，按每孔1 mL接种至24 孔板中，用不同浓度的HDS 药物处理，放入培养箱培养；至处理时间点时收集细胞至流式管中，按照“先慢后快”的原则，逐滴向每管加入1 mL预冷（-20 ℃）的70%乙醇，-20 ℃固定至少12 h，检测当天离心并用PBS 清洗1 遍后，每管加300 μL 的细胞周期检测试剂PI/RNase，室温避光孵育30 min后，用流式细胞仪检测。

1.2.5 细胞凋亡检测

收集对数生长期的Jurkat 和Hut-78 细胞，配成密度为2×105～3×105个/mL的细胞悬液，按每孔1 mL接种至24孔板中，每孔按不同浓度加入HDS药物处理，放入培养箱培养；至处理时间点时收集细胞至流式管中，每管加入2.5 μL Annexin-V-FITC 和50 μL 1× Binding Buffer，室温避光染色15 min；每管加入5 μL PI 和250 μL 1×Binding Buffer，室温避光染色5 min 后，用流式细胞仪检测。读取数据，计算细胞凋亡百分比。

1.2.6 Western blot检测

收集对数生长期的Jurkat 和Hut-78 细胞，配成密度为2×105～3×105个/mL的细胞悬液，按不同浓度加入HDS 药物处理48 h 后，用RIPA 蛋白裂解液提取细胞总蛋白并进行蛋白定量，加入SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液，取20 μL 蛋白进行SDS-PAGE 电泳后转移于硝化纤维素（NC）微孔滤膜，5%BSA 封闭1 h 后进行抗体孵育（4 ℃冰箱过夜）。次日用PBST清洗NC 膜3 遍以后，根据一抗种属进行二抗孵育（室温，1 h），再用PBST清洗3遍。Amersham Imager 600 自动化学发光凝胶成像仪曝光检测并保存图片，用Image J软件对图片进行分析。

1.2.7 γ-H2AX免疫荧光法

收集对数生长期的Jurkat 和Hut-78 细胞，配成密度为2×105～3×105个/mL的细胞悬液，按不同浓度加入HDS药物处理48 h后，用PBS清洗1次，按细胞沉淀∶PBS=1∶20（体积比）的比例加入适量PBS重悬细胞，混匀后每个样品取50 μL 均匀涂片于正电荷黏附防脱载玻片上（涂片面积约为1 cm×1 cm），经4%多聚甲醛固定、0.5% Triton X-100 破膜、0.5%BSA 封闭、一抗γ-H2AX 抗体孵育（4 ℃冰箱过夜）、R488标记的二抗孵育（室温，1 h）、DAPI孵育10 min、防荧光淬灭剂封片后，激光扫描共聚焦显微镜观察γ-H2AX阳性细胞，并拍照。

1.2.8 裸鼠移植瘤与HDS的抗肿瘤活性检测

收集对数生长期的Jurkat 细胞，无菌PBS 清洗2 次并用其配成密度为2×107个/mL 的细胞悬液，与基质胶按体积比1∶1混匀置于冰上备用。裸鼠注射部位消毒后，用1 mL 注射器抽取细胞悬液，皮下注射100 μL，定期观察裸鼠情况。待移植瘤长至约0.5 cm×0.5 cm时，将裸鼠随机分为对照组和HDS处理组。HDS处理组腹腔注射HDS 100 mg/（kg·d），对照组注射同体积的溶剂DMSO。每日记录裸鼠移植瘤的大小，至实验结束，裸鼠安乐死后，剥离皮下肿瘤组织，并收集裸鼠心脏、肝脏和肾脏组织，在4%多聚甲醛中固定备用。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0进行统计分析。数据以均数±标准差（）表示；实验组与对照组间比较采用Student’st检验；多组比较采用单因素方差分析（oneway ANOVA），各组之间的两两比较采用SNK 法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HDS 可抑制T 淋巴细胞白血病细胞的增殖和克隆形成

HDS 是一种临床批准的药物，其相对分子量为229.24 Da（图1A）。为了确定HDS 是否具有抗T 淋巴细胞白血病肿瘤的能力，将不同浓度的HDS（0、25、50、75、100、150、200、300、400 μmol/L）分别作用于T 淋巴细胞白血病细胞株Jurkat 和Hut-78 细胞24、48、72 h。HDS对T淋巴细胞白血病细胞株有细胞毒性，且表现出剂量和时间依赖性（图1B、C）。HDS作用48 h后，Jurkat和Hut-78细胞半数抑制浓度（IC50值）分别为151.18 μmol/L 和173.67 μmol/L。琼脂集落形成法检测不同浓度的HDS 对Jurkat 和Hut-78 细胞集落形成能力的影响。结果显示，HDS可显著抑制两种细胞系的集落形成，且集落形成数与药物浓度呈负相关（图1D、E）。

图1 HDS可抑制T淋巴细胞白血病细胞的增殖和克隆形成Figure 1 HDS can inhibit the proliferation and colony formation of T-lymphoblastic leukemia cells

2.2 HDS 可诱导T 淋巴细胞白血病细胞停滞于细胞周期S期

为探讨HDS对T淋巴细胞白血病细胞细胞周期的影响，用不同浓度的HDS 作用于Jurkat 和Hut-78细胞（0、100、300 μmol/L）48 h，然后用碘化丙啶（PI）染色和流式细胞术分析细胞周期。结果显示，处于S期的Jurkat（图2A）和Hut-78（图2B）细胞群比例逐渐增高，且呈浓度依赖性（图2C、D）。Western blot实验结果也表明，经HDS处理，Jurkat和Hut-78细胞的Cdc25A、CDK2、Cyclin A2 表达水平明显下调（图2E～G）。综上所述，HDS通过抑制Cdc25A、CDK2和Cyclin A2 等细胞周期S 期相关蛋白的表达，使T 淋巴细胞白血病细胞停滞于细胞周期S期。

图2 HDS可诱导T淋巴细胞白血病细胞停滞于细胞周期S期Figure 2 HDS can induce cell cycle arrest at S phase of T-lymphoblastic leukemia cells

2.3 HDS可诱导T淋巴细胞白血病细胞凋亡

为了进一步探讨HDS对T淋巴细胞白血病细胞的影响，并确定T淋巴细胞白血病细胞的增殖抑制是否是通过诱导凋亡而引起，用不同浓度的HDS（0、25、50、100、300 μmol/L）处理Jurkat 和Hut-78 细胞48 h（图3A、B）。细胞流式结果表明，HDS 可显著促进Jurkat 和Hut-78 细胞的凋亡，且呈浓度依赖性（图3C、D）。同时，通过免疫印迹法检测细胞凋亡相关蛋白Bad、Bax、Bcl-XL和Bcl-2的表达。结果显示，在两细胞系中，促凋亡蛋白Bad和Bax表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-XL和Bcl-2表达降低，且呈剂量依赖关系（图3E～G）。这些结果与流式细胞检测的趋势是一致的，即HDS可显著诱导T淋巴细胞白血病细胞的凋亡。

图3 HDS可诱导T淋巴细胞白血病细胞凋亡Figure 3 HDS can induce the apoptosis of T-lymphoblastic leukemia cells

2.4 HDS 可通过CHK1/CHK2 信号通路阻断T 淋巴细胞白血病细胞的DNA损伤修复过程

为了确定HDS 是否影响T 淋巴细胞白血病细胞的DNA 损伤修复过程，进而加重细胞DNA 损伤，以100 μmol/L 和300 μmol/L 的HDS 处理Jurkat（图4A）和Hut-78（图4B）细胞48 h，并检测DNA 合成损伤的标志基因γ-H2AX 的表达。结果显示，与对照组相比，HDS处理组中，Jurkat和Hut-78细胞γ-H2AX 阳性细胞比例明显增加，且呈剂量依赖关系（图4C、D）。同时，用免疫印迹法检测DNA 损伤相关蛋白CHK1、p-CHK1、CHK2、p-CHK2和γ-H2AX的表达水平（图4E～G）。结果表明，γ-H2AX的表达与免疫荧光染色数据的趋势相一致，且HDS 可通过磷酸化相应的下游分子CHK1 和CHK2，抑制DNA 损伤修复过程，导致T 淋巴细胞白血病细胞DNA 损伤加重。

图4 HDS可通过CHK1/CHK2信号通路阻断T淋巴细胞白血病细胞的DNA损伤修复过程Figure 4 HDS can block the DNA damage repair process of T-lymphoblastic leukemia cells through the CHK1/CHK2 signaling pathway

2.5 HDS 可抑制小鼠中T 淋巴细胞白血病肿瘤的生长

建立裸鼠皮下T淋巴细胞白血病细胞异种移植模型来研究HDS对T淋巴细胞白血病肿瘤的治疗效果。采用5 周龄BALB/c 裸鼠，皮下注射Jurkat 细胞（1×107个/只）。小鼠T淋巴细胞白血病肿瘤形成后，HDS组每只每天腹腔注射100 mg/kg HDS，对照组注射等量的DMSO，同时每天测量肿瘤大小和小鼠体重，共13 d。数据显示，与对照组相比，经HDS处理的小鼠，其T 淋巴细胞白血病肿瘤生长明显受到抑制（图5A、B）。但HDS组与对照组小鼠体重无显著差异（图5C）。

图5 HDS可抑制小鼠中T淋巴细胞白血病肿瘤的生长Figure 5 HDS can inhibit the growth of T-cell lymphoblastic leukemia tumors in mice

HDS 处理13 d 后，取动物的肿瘤组织，进行切片和苏木精-伊红染色，结果显示HDS 组小鼠的肿瘤组织坏死明显增加，但心脏、肝脏和肾脏组织没有明显变化（图5D）。上述实验结果表明，HDS可抑制小鼠体内移植的T 淋巴细胞白血病肿瘤，但对小鼠无明显毒性。

将肿瘤组织切片进行免疫组化染色分析，数据显示，HDS 组小鼠肿瘤组织中，Ki67 阳性细胞比例较对照组明显降低，γ-H2AX 阳性细胞比例较对照组明显升高（图5E），表明在小鼠体内，HDS 亦可显著诱导T 淋巴细胞白血病细胞DNA 损伤，抑制T 淋巴细胞白血病细胞的增殖。

3 讨论

急性淋巴细胞白血病是一种侵袭性肿瘤，目前针对T 淋巴细胞白血病的治疗方案效果较差，疾病复发率与死亡率仍非常高［1-2］。因此，开发新的药物和治疗策略非常有意义。

本研究以T 淋巴细胞白血病细胞株Jurkat 和Hut-78 细胞为研究对象，探讨HDS 对T 淋巴细胞白血病的体外治疗作用。通过CCK-8 和克隆形成实验，发现HDS 以剂量和时间依赖的方式显著抑制T淋巴细胞白血病细胞的生长。CCK-8 结果表明，HDS 通过下调T 淋巴细胞白血病细胞中Cdc25A、CDK2 和Cyclin A2 的蛋白水平，以剂量和时间依赖的方式阻断细胞周期的S期。

除了细胞周期停滞外，细胞死亡也可能导致肿瘤抑制［18］。细胞凋亡是细胞死亡的常见亚型［19］。因此，研究了HDS 作用后T 淋巴细胞白血病细胞的凋亡表型。Annexin V/PI 双重染色和流式细胞仪检测结果显示，T 淋巴细胞白血病细胞株Jurkat 和Hut-78 细胞发生明显的细胞凋亡，在特定剂量下培养48 h，凋亡率为60%～80%。此外，Bad、Bax、Bcl-2和Bcl-XL 在细胞凋亡中起重要作用［19］。HDS 处理肿瘤细胞后，Western blot结果表明，促凋亡蛋白Bax和Bad表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL表达降低，呈剂量依赖关系，提示这可能是HDS抗T淋巴细胞白血病的相关机制。此外，与细胞凋亡相关的详细通路还有待进一步探索。

HDS 是一种与核糖核苷酸还原酶亚单位M2（ribonucleotide reductase small subunit M2，RRM2）受体竞争结合的RNR抑制剂。RNR在DNA损伤修复中发挥关键作用［16］。此外，关于HDS在其他类型肿瘤中的研究也很多，如肝细胞癌［13］。研究认为，HDS可能会干扰DNA损伤修复过程。γ-H2AX染色结果显示，经HDS 处理的细胞DNA 损伤加重。蛋白免疫印迹结果显示，HDS 处理上调了p-CHK1 和p-CHK2 的表达。CHK2 是一种位于DNA 损伤检查点的限速蛋白，可以指导与S 期细胞周期停滞相关的Cdc25A［20-21］。ATM/ATR 可以反映DNA 损伤，并将信号传递给其下游分子CHK2/CHK1，最终导致细胞周期停滞或凋亡［22-23］。

为了进一步验证药物的有效性和安全性，建立了T 淋巴细胞白血病异种移植小鼠模型。在体内，HDS可以抑制小鼠T淋巴细胞白血病肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，从而增加肿瘤组织坏死，但对小鼠的心脏、肝脏等其他器官没有明显影响，表明HDS 对T 淋巴细胞白血病肿瘤具有杀伤作用，且无明显毒性。结合体外实验数据，表明HDS可有效杀伤T 淋巴细胞白血病细胞，可作为治疗T 淋巴细胞白血病的靶向药物。

HDS 在抗肿瘤方面有其独特优势。首先，HDS是一种成分清晰、结构稳定的复方药物，可以在体外合成；其次，它已被临床批准用于肝胆疾病，本研究将旧药用于新的目的，改变现有药物的用途，可以显著降低新药开发的费用和时间；此外，HDS 作为一种临床药物对T淋巴细胞白血病具有明显的疗效和安全性。

HDS在T淋巴细胞白血病治疗中的应用仍需进一步探索。首先，目前尚不清楚在停药期间移植的T 淋巴细胞白血病肿瘤是否会复发；其次，HDS 抗T淋巴细胞白血病肿瘤的具体机制除诱导细胞凋亡和细胞周期停滞外，还有待进一步研究；最后，HDS作为RNR 抑制剂，可以影响RRM2 的活性，需要进一步找出HDS 作用RNR 的亚型以及与这些还原酶结合的金属因子，这可能涉及细胞铁死亡或与金属离子相关的其他形式的细胞死亡［10］。

综上所述，体外和体内实验均显示，HDS对T淋巴细胞白血病有良好的治疗效果。它可促进细胞凋亡、通过CHK1/CHK2信号通路加重DNA损伤，且可诱导S 期细胞周期停滞等途径抑制细胞增殖。HDS已被批准用于肝病治疗，为进一步临床应用于T淋巴细胞白血病患者提供了理论依据。本研究也为进一步开发和优化其他药物的使用策略提供了依据。