LC-MS/MS测定牛奶中四环素残留量的不确定度评定

冯翀 王小乔 潘秀丽 马建忠

摘 要：目的：分析评定《食品安全国家标准 动物性食品中四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》（GB 31658.17—2021）检验方法中牛奶兽药残留四环素测量结果的不确定度。方法：根据《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）、参照GB 31658.17—2021方法测定牛奶中四环素含量。通过对牛奶中四环素残留量检测过程中相关不确定度分量进行数学建模，分析评定牛奶中兽药残留四环素测量结果的不确定度。结果：牛奶中四环素测量的扩展不确定度为1.197 4 μg·kg-1，牛奶中四环素残留量测定结果为（41.58±1.197 4） μg·kg（k=2）。结论：在四环素的检测中，可通过控制标准溶液的配制过程、增加标准曲线溶液的测量次数和提高仪器的稳定性和灵敏度等方法來提高四环素检测结果的准确性和可靠性。

关键词：牛奶；四环素；不确定度；评定

Abstract： Objective： To analyze and evaluate the uncertainty of the measurement results of tetracycline residue in milk in GB 31658.17—2021 test method. Method： The content of tetracycline in milk was determined according to JJF 1059.1—2012 and GB 31658.17—2021. The uncertainty of the measurement result of tetracycline residue in milk was analyzed and evaluated by mathematical modeling of the correlation uncertainty in the detection process of tetracycline residue in milk. Result： The extended uncertainty of the measurement of tetracycline in milk was 1.197 4 μg·kg-1， and the residual determination of tetracycline in milk was （41.58±1.197 4） μg·kg-1 （k=2）. Conclusion： The accuracy and reliability of tetracycline detection can be improved by controlling the preparation process of the standard solution， increasing the measurement times of the standard curve solution and improving the stability and sensitivity of the instrument.

Keywords： milk; tetracycline; uncertainty; evaluation

四环素类抗生素是由放线菌产生，具有抑菌作用，是畜牧养殖业治疗和控制传染病的最重要的广谱抗生素之一，对肺炎球菌、衣原体和支原体等有防治作用[1]，被广泛应用于动物疾病的预防和治疗[2]。因四环素在畜牧养殖中的滥用，造成牛奶中四环素药物残留，使得牛奶食品安全存在一定风险[3]。测定牛奶中四环素的标准方法主要是LC-MS/MS法。评定测量结果的不确定度是确认四环素残留量检测准确性的主要方法。本文参照《食品安全国家标准 动物性食品中四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》（GB 31658.17—2021）、《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）进行牛奶中四环素残留量的不确定度评定，查找影响四环素残留量检测过程的关键因素，在检测过程中，把控影响检验结果的关键因子，以期提高检验结果的准确性和科学性，为政府部门监管牛奶食品安全以及企业控制牛奶的产品质量提供帮助[4]。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

牛奶，超市购买。

四环素标准品（纯度：96.9%）；色谱纯甲醇；色谱纯乙腈；色谱纯甲酸；超纯水等。

安捷伦高效液相色谱质谱联用仪；旋涡振荡仪；电子天平；移液器等。

1.2 实验方法

1.2.1 检验依据

检测依据为《食品安全国家标准 动物性食品中四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》（GB 31658.17—2021）。

1.2.2 样品处理

精密称取5 g牛奶样品，放入50 mL离心管中，加入陶瓷均质子和8 mL Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液。使用旋涡振荡仪对离心管涡旋处理1 min，再经超声处理后收集离心管中的上清液。在离心管剩余残渣中加入8 mL磷酸盐缓冲液，重复上述操作，再次提取上清液。将两次提取到的上清液合并，混匀后，净化提取液，收集洗脱液，氮吹至干。在吹干后的洗脱液中加入1.00 mL复溶液（水∶甲醇∶乙腈=8∶1∶1），涡旋处理1 min，离心处理5 min（14 000 r·min-1），经微孔滤膜过滤后，上机测定该牛奶样品待测液[5]。

2 结果与分析

2.1 测量不确定度的来源分析

根据牛奶中四环素残留量测定过程，可以得到牛奶中四环素残留量的不确定度来自牛奶样品称量、标准物质称量和溶液配制、仪器检测以及测量过程中的随机效应，分别计算对牛奶四环素残留量检测结果有影响的不确定度的分量，即牛奶样品称样量引入的相对标准不确定度urel（m）、牛奶样品定容体积引入的相对标准不确定度urel（V）、牛奶样品浓度测量引入的相对标准不确定度urel（c）和样品重复性实验引入的相对标准不确定度urel（ref），评定LC-MS/MS测定牛奶中四环素的不确定度。

2.2 不确定度分量的评定

2.2.1 牛奶样品称样引入的相对标准不确定度urel（m）

精密称取5 g牛奶样品，按照均匀分布，k=，当天平最大允许差为±0.5 mg时，牛奶样品质量引入的标准不确定度为

万分之一的天平分辨率为0.1 mg时，牛奶样品质量引入的标准不确定度为

则牛奶样品称取样引入的相对标准不确定度为

2.2.2 牛奶样品定容体积引入的相对标准不确定度urel（V）

使用最大允许误差为0.60%的艾本德1 mL移液枪定容样品溶液，按照均匀分布，定容牛奶样品体积V的引入的标准不确定度为

考虑到温度效应，假设在实验室温度（20±3） ℃下进行定容，水的膨胀系数为2.1×10-4 ℃-1，则水的膨胀系数引入的不确定度为

甲醇的膨胀系数为1.19×10-3 ℃-1，则甲醇的膨胀系数引入的不确定度为

乙腈的膨系数为1.37×10-3 ℃-1，则乙腈的膨胀系数引入的不确定度为

则定容牛奶样品体积引入的相对标准不确定度为

2.2.3 牛奶样品浓度测量引入的相对标准不确定度urel（c）

（1）四环素标准曲线配制引入的相对标准不确定度urel1（c）。四环素标准品一级储备液制备引入的不确定度urel1（c1）。使用最大允许误差为±0.05 mg的十万分之一天平称取四环素标准物10.84 mg。按照均匀分布，称量四环素对照品引起的相对标准不确定度为

将上述称量的对照品定容至10 mL A级容量瓶（最大允许误差为±0.02 mL）。假设在实验室温度（20±5） ℃下进行定容，甲醇的膨胀系数为

1.19×10-3/℃-1，按照三角分布，k=，此时四环素标准品定容引入的标准不确定度为

则四环素标准品一级储备液配制引入的相对标准不确定度为

四环素标准品一级储备液稀释引入的不确定度urel1（c2）。将一级标准储备液稀释成混合标准使用溶液，所用的器具为100 μL移液枪和100 mL A级容量瓶。使用100 mL A级容量瓶定容引入的不确定度为urel1（c2A）。100 mL A级容量瓶20 ℃时允许误差为±0.10 mL，假设服从三角分布，体积引入的相对标准不确定度为

与校正时温度不同引起的相对标准不确定度为

则100 mL A级容量瓶引入的相对标准不确定度为

使用100 μL移液枪移液引入的不确定度urel1（c2B）。100 μL移液枪20 ℃时允许误差为±0.60%，假设服从均匀分布，体积引入的相对标准不确定度为

与校正时温度不同引起的相对标准不确定度为

则100 μL移液枪引入的相对标准不确定度为

因此，将四环素一级标准储备溶液稀释成浓度为1.050 μg·mL-1标准使用液过程引入的相对标准不确定为

用10 mL A级容量瓶、艾本德100 μL移液枪和艾本德1 mL移液枪将1 050 ng·mL-1的工作溶液配制成浓度为21.00 ng·mL-1、52.50 ng·mL-1、105.00 ng·mL-1、210.00 ng·mL-1、420.00 ng·mL-1和630.00 ng·mL-1的标准曲线溶液，四环素标准曲线制备过程引入的相对标准不确定度urel1（c3A）。使用10 mL A级容量瓶定容引入的相对标准不确定度urel1（c3A）。10 mL A级容量瓶20 ℃时允许误差为±0.02 mL，假设服从三角分布，则体积引入的相对标准不确定度为

与校正时温度不同引起的相对标准不确定度为

10 mL A级容量瓶引入的相对标准不确定度为

使用100 μL移液枪移液引入的相对标准不确定度urel1（c3B）。100 μL移液枪20 ℃时允许误差为±0.60%，假设服从均匀分布，体积引入的相对标准不确定度为

與校正时温度不同引入的相对标准不确定度为

100 μL移液枪引入的相对标准不确定度为

使用1 mL移液枪移液引入的相对标准不确定度urel1（c3C）。1 mL移液枪20 ℃时允许误差为±0.60%，假设服从均匀分布，体积引入的相对标准不确定度为

与校正时温度不同引入的相对标准不确定度为

1 mL移液枪引入的相对标准不确定度为

故四环素标准曲线制备过程引入的相对标准不确定度为

则四环素标准曲线配制引入的相对标准不确定度为

（2）四环素标准曲线拟合时引入的相对标准不确定度urel2（c）。四环素标准曲线拟合时引入的样品溶液中四环素浓度的标准不确定度u2（c）为

式中：Sy为标准曲线的标准差；n为标准曲线校准点的测量次数；a为校准曲线的斜率；b为校准曲线的截距；Ai为第i次测量时标准溶液的峰面积；ci为第i次测量时标准溶液的浓度，ng·mL-1。

则四环素标准曲线线性方程及其拟合引入的相对标准不确定度为

c为四环素标准溶液浓度点的平均浓度，

则牛奶样品浓度测量引入的相对标准不确定为

2.2.4 样品重复性实验引入的相对标准不确定度urel（ref ）

取空白牛奶样品加标，加标含量为45 μg·kg-1，经提取处理后上机，用标准曲线重复测试加标样品6次，通过计算得到样品重复性测定引入的相对不确定度。

标准偏差的计算公式为

式中：x为牛奶样品四环素含量6次检测的平均值，x=41.58 μg·kg-1；n为检测次数，n=6；xi为重复性实验中的单次测定值，μg·kg-1。

样品重复性实验引入的标准不确定度为

样品重复性实验引入的相对标准不确定度为

2.3 合成不确定度urel（X ）

牛奶中四环素含量测定不确定度的来源如表1所示。

牛奶中四环素检测结果的合成相对标准不确定度为

通过计算得到牛奶样品的平均值为41.58 μg·kg-1，因此合成标准不确定度为

2.4 牛奶四环素残留量测量结果及不确定度评定报告

置信概率取95%时，包含因子k=2，则扩展不确定度为Up=u（X）×k=0.598 7×2=1.197 4 μg·kg-1。则称取5 g牛奶样品时，牛奶中的四环素含量为（41.58±1.197 4） μg·kg-1（k=2）。

3 结论

结果表明，牛奶样品浓度测量是影响实验结果的最大因素，标准曲线的绘制、标准物质的纯度等都会对不确定度评定产生大的影响，因此可以采取以下措施降低不确定度，如使用纯度更高的标准物质，减少四环素标准使用液的稀释步骤，使用适合量程的移液设备，通过增加质量控制、人员比对等方式降低随机误差，增强检测人员的专业技能水平，提升仪器设备的精确性，最终把控影响检验结果的关键因子，降低随机误差以及测量不确定度，确保检验检测过程及结果的准确性和可靠性[6]。

参考文献

[1]谷悦，唐会鑫，李朔，等.QuEChERS-超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法测定水果制品和肉酱中10种四环素类抗生素[J/OL].食品工业科技：1-15[2023-05-24].https：//kns.cnki.net/kcms2/article/abstract？v=3uoqIhG8C45S0n9fL2suRadTyEVl2pW9UrhTDCdPD65GWj5UxcG6fgv-7SQ3eLwaJ9UfNtWc5GYdDaErX6d63siPFtfYRAGt&uniplatform=NZKPT.

[2]刘长勇，卢春霞，唐宗贵，等.基于无标记适配体-纳米金比色快速检测四环素类抗生素[J/OL].现代食品科技：1-8[2023-05-24].https：//kns.cnki.net/kcms2/article/abstract？v=3uoqIhG8C45S0n9fL2suRadTyEVl2pW9UrhTDCdPD65uuULF3v3RBsyiTdlMTDrgq36_tDXetU9Xpm2aF0Q4pbkFfS8yQAlh&uniplatform=NZKPT.

[3]陈文静，李明，林洪，等.生物质衍生荧光碳点高灵敏检测环境水样中四环素[J].分析科学学报，2023，39（1）：21-26.

[4]何咏欣，陈嘉欣，龚海锟.液相色谱-串联质谱法测定虾类中四环素类物质的不确定度评定[J].现代食品，2022，28（21）：159-165.

[5]陈琨，周劭桓，廖艳华.液相色谱-串联质谱法测定鸭肉基质中四环素类的不确定度评定[J].应用预防医学，2016，22（5）：463-466.

[6]陳梦，范蕾，蒋凯亚，等.高效液相色谱法测定牛奶中四环素类兽药残留量的不确定度评定[J].食品安全质量检测学报，2020，11（15）：5088-5093.