濒危药用植物竹节参种子形态特征与萌发特性研究

李小玲，周武先，李大荣，余爱冬，张美德*

（1.湖北省农业科学院中药材研究所，湖北恩施 445000；2.农业农村部中药材生物学与栽培重点实验室，湖北武汉 430074；3.马应龙药业集团股份有限公司，湖北武汉 430064）

竹节参[Panax japonicus（T.Nees）C.A.Mey.]为五加科人参属多年生草本植物，以根茎入药，具有散瘀止血、消肿止痛、祛痰止咳、补虚强壮之功效，是中华人民共和国药典（2020 版）收载品种[1]。现代药理学研究表明，其主要功效组分如皂苷、糖类、氨基酸和挥发油等物质具有抗炎镇痛、保护心脑血管、抗肿瘤、抗病毒等多种药理作用[2-6]。竹节参由于具有较高的药用价值和经济价值而逐渐引起诸多学者的关注，但严苛的生长条件、漫长的生长周期、较低的种子成苗率以及无节制的开采等因素导致原本零星分布的野生竹节参资源逐年消耗殆尽，目前已处于濒危状态[7]。20 世纪80 年代，湖北省农业科学研究院中药材研究所对竹节参野生转家植栽培研究取得成功。目前，恩施州内新塘乡、石窑乡、椿木营乡等周边有小规模栽培，现有的竹节参野生资源十分稀缺[8]。人工种植已成为竹节参原料供应的主要途径，而种子繁殖是人工栽培的关键环节，竹节参种子的休眠特性导致其繁育效率较低，无法实现高效种植与生产。因此，如何有效缩短竹节参种子的萌发周期，促进实生苗快速生长，对于实现竹节参规模化生产具有重要意义。

种子是植物特有的延存器官，种子能否顺利萌发对植物的生存和繁衍具有决定性作用[8]。而种子的萌发又是一个极其复杂的过程，是内外因素共同作用的结果[9-11]。诸多研究指出，湿沙储藏能够促进竹节参种子完成“胚后熟”过程，提高种子萌发率[5，11]。周立业等[12]研究发现，400 mg/L的赤霉素浸泡防风种子24 h，可有效打破种子休眠并促进萌发。闫晓娜等[13]研究3 种激素处理对偃松种子萌发及其生理生化的影响，结果表明10 mg/L 和100 mg/L GA3对种子萌发有促进作用，能够提高种子发芽率和发芽势，而IAA 对偃松种子萌发的促进作用较小，其可能原因在于IAA 主要作用于茎的生长，而GA3则对根尖分生组织和种子萌发过程具有明显促进作用。何丽霞等[14]发现，1 mmol/L 6-BA 溶液处理的小构种子的萌发率较对照提高1.50%。可见，植物激素已在打破种子休眠、促进种子萌发研究中得到了广泛应用。事实上，由于激素种类、浓度、物种多样性以及立地环境的差异，不同激素的作用效果往往存在很大的差异。该研究通过观察室温湿沙储藏过程中竹节参种子的胚发育状况，并采用不同浓度的赤霉素（GA3）、吲哚乙酸（IAA）和6-苄基腺嘌呤（6-BA）溶液对竹节参种子进行处理，研究不同激素处理对种子萌发率及幼苗生长的影响，以期筛选出能够促进种子萌发的最佳方法，为竹节参种子高效繁育提供科学依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

竹节参种子于2021 年8 月购自湖北省恩施市板桥镇新田村农户。种子采回经去杂清理后进行千粒重、种径测定，并置于温度为4℃的冰箱保存，备用。

1.2 方法

1.2.1 种子水分、形态及生活力测定。

（1）水分测定。随机抽取1 000 粒种子，使用千分之一天平（Sartorius，BSA223S）进行称重，重复3 次，测定种子千粒重。随机抽取30 粒种子，使用游标卡尺测定种子纵径和横径。采用加热烘干法测定种子的含水量[15]，设3 个重复，每个重复取竹节参种子100 粒，于60℃烘干至恒重。

（2）种子生活力测定。采用TTC 染色法[16]，取30 粒发育饱满的种子，沿其背轴线纵切，并将纵切面朝下放置于直径9 cm 的培养皿内，在培养皿中倒入pH 6.8 的0.2%TTC 染色液将种子浸泡，重复3 次，染色结束后统计有生活力的种子数量。

1.2.2 沙藏处理。2021 年9 月，采用水选法选取3 000 粒饱满种子，用0.5% KMnO4浸泡消毒30 min，清水冲洗，滤干备用。将种子与细河沙按1∶2 比例混匀后置于塑料花盆（12 cm×11.5 cm×14.5 cm）中室温沙藏，完成胚的后熟，并且在层积过程中保持河沙的湿度在60%～70%左右。整个沙藏过程持续180 d，每间隔60 d 取样1 次，共取3次，参照安瑞朋等[17]的方法，徒手切片后在体式显微镜下观测竹节参种胚形态，并进行拍照记录。

1.2.3 外源激素处理。采用单因素试验，分别探究不同植物激素处理对竹节参种子萌发的影响。取一批已完成“胚后熟”（沙藏90 d 左右）的竹节参种子分别放入不同浓度的激素中处理，即蒸馏水（CK）、GA3（50、150、250 mg/L）、IAA（50、150、250 mg/L）、6-BA（5、25、45 mg/L）溶液中常温浸种24 h。取出后晾干，用湿度在60%～70%左右的细河沙进行沙藏。湿沙储藏试验的所有处理均设3 次重复，每个重复100 粒种子。期间根据河沙的水分蒸发情况适量补充水分保持湿度。在湿沙储藏的最后1 个月内密切观察并记录种子的萌发情况。

1.3 数据统计与处理

（1）种子的发芽率计算公式如下[18]：

发芽率=（正常萌发种子数/供试种子数）×100%

（2）种子的活力和含水量计算公式如下：

种子活力=（着色种子数/供试种子数）×100%

种子含水量=（干燥前供检种子质量-干燥后供检种子质量/干燥前供检种子质量）×100%

采用单因素方差分析（One-way ANOVA）检验3 种激素处理间的差异显著性，使用Duncan 法进行多重比较（P=0.05）。采用线性相关分析法比较竹节参幼苗根长和茎长的关系（图表中数据均为平均值±标准差）。

2 结果与分析

2.1 竹节参种子的生物学特征

从表1 可以看出，竹节参种子的千粒重为36.83 g。根据高温烘干法测定竹节参种子含水量为54.64%。根据TTC法测定竹节参种子生活力的结果表明，竹节参种子生活力为85.12%（图1）。竹节参种子外形为卵球形，长4.96 mm，宽3.63 mm，外种皮为黄色，坚硬革质。内种皮薄膜状，尖端有脐孔，沿脐孔有结合缝，萌发时胚根由脐孔处突破种皮。新鲜成熟的竹节参种胚为多个细胞组成的团粒，此时的种子处于形态生理休眠阶段，尚未完成胚的后熟过程。随着层积时间的推移，竹节参种胚由最初的椭圆形胚阶段（0 和30 d）逐渐过渡到鱼雷形胚阶段（60 d）、马蹄形胚阶段（120 d），并最终完成胚的后熟过程。期间胚乳伴随着胚的分化而不断膨胀，时而使外种皮开裂。在层积120 d时，胚乳分化成熟，2 片子叶清晰可见，胚柄逐渐伸长。最终胚根突破种皮，完成种子萌发（180 d）。湿沙储藏有利于竹节参种子胚发育，同时水分管理至关重要（图2）。

图1 TTC 法鉴定竹节参种子活力

图2 不同萌发时期竹节参种子形态观察

表1 竹节参种子千粒重及含水量

2.2 外源激素对竹节参种子萌发的影响

从图3 可以看出，不同外源激素类型对竹节参种子萌发的影响存在差异。竹节参种子在GA3150 和250 mg/L时，其发芽率较对照分别显著提高了17.24%和38.57%（P＜0.05）（图3A 和图4）。不同浓度的IAA 处理均对竹节参种子的萌发有显著抑制作用（P＜0.05），竹节参种子的萌发率在50、150 和250 mg/L 的IAA 处理下较对照分别显著降低了35.71%、28.57%和21.43%（图3B）。不同浓度的6-BA 对竹节参种子萌发率的影响不显著（P＞0.05）（图3C）。

图3 不同激素种类处理对竹节参种子萌发的影响

图4 不同浓度GA3 处理下竹节参种子的萌发效果

2.3 外源激素对竹节参种子幼苗生长的影响

从图5 可以看出，不同外源激素类型对竹节参幼苗茎生长的影响存在差异。较高浓度的GA3处理显著促进竹节参幼苗茎的生长（P＜0.05），150 和250 mg/L GA3处理下的茎长分别是对照处理的3 倍和7 倍（图5A）。与对照相比，不同浓度的IAA 处理均显著促进竹节参幼苗茎的生长（P＜0.05），但是其促进作用随着IAA 浓度的升高先增强后减弱。50、150、250 mg/L IAA 处理下的茎长分别是对照的1.7 倍、2.7 倍和1.9 倍（图5B）。与对照相比，低浓度的6-BA处理显著促进竹节参幼苗茎生长（P＜0.05）。5 和25 mg/L 6-BA处理下的竹节参幼苗茎长分别是对照的2.1 倍和2.3 倍，而45 mg/L 6-BA 对其茎生长无影响（P＞0.05）（图5C）。

图5 不同激素种类处理对竹节参幼苗生长的影响

不同外源激素类型对竹节参幼苗根系生长的影响存在差异。50 mg/L GA3处理对竹节参根系生长没有影响（P＞0.05），而较高浓度的GA3显著抑制其根系生长（P＜0.05），150 和250 mg/L GA3处理下的根长较对照分别减少20%和60%。平均而言，IAA 处理对竹节参根系生长有一定促进作用，50 和250 mg/L IAA 处理下的根长分别是对照的2.5 倍和2.3 倍。仅较高浓度的6-BA 处理显著促进竹节参根系生长（P＜0.05），45 mg/L 6-BA 处理下的根长是对照的3.1 倍，其余处理间无统计学差异（P＞0.05）。

3 结论与讨论

研究采用3 种植物激素处理竹节参种子的结果发现，250 mg/L GA3可有效提高竹节参种子的萌发效果。3种植物激素均对竹节参幼苗的生长有一定促进作用，其作用效果因种类和浓度不同而存在差异。250 mg/L GA3处理下竹节参茎长平均值达到54 mm，其次是150 mg/L IAA和25 mg/L 6-BA，竹节参茎长平均值分别为23 mm 和20 mm。因此，在进行竹节参人工栽培育苗的过程中，湿沙储藏结合250 mg/L GA3浸种可有效提高种子发芽率，促使出苗更加整齐，可作为竹节参种苗高效繁育的重要手段。

竹节参在鲜果成熟时，种胚发育不完全且处于球形胚阶段，种子具有休眠特性。湿沙储藏能够有效促进竹节参种子完成“胚后熟”过程，实现种子萌发。外源激素在促进药用植物种子萌发、胚胎发育以及解除种子休眠等方面取得了较好的效果[19-20]。研究指出，赤霉素通过诱导植物相关基因的表达，控制酶蛋白的合成以及内源生长调节物质的分泌，以此促进植物体内的生理代谢反应，从而提高种子萌发率[21]。该研究中，150 和250 mg/L GA3对竹节参种子萌发有显著促进作用，这表明GA3浸种可以有效解除竹节参种子的休眠，其可能的原因是GA3能够调控种子内部的激素比例，促使休眠种子恢复伸长生长，当完成“胚后熟”过程后，外种皮破裂，种子萌发[22]。该研究中当GA3浓度达到最高时，竹节参种子的发芽率还有上升空间，因此后期应进一步开展更高浓度的GA3对竹节参种子萌发的研究。

闫艳华[24]开展外源激素处理曼陀罗种子试验，结果显示种子的发芽率随着IAA 浓度的升高而逐渐提高且明显高于对照处理，25 mg/L IAA 处理下的发芽率最高，长势最好。在该研究中，不同浓度的IAA 处理均对竹节参种子的萌发有显著抑制作用。这与以往研究结果不一致，可能是由于IAA 作用的效果及浓度在不同物种存在差异。此外，有研究指出，刺槐和红花槐的种子萌发率在40 mg/L IAA时达到最大值，随着浓度的继续增加，种子的发芽率逐渐下降[25]。建议该研究后期应开展更低浓度的IAA 对竹节参种子发芽率的研究。

6-BA 是一种人工合成的细胞分裂素，可促进细胞分裂、诱导芽分化，还可调控营养物质在植物体内的运输、促进新陈代谢，且有利于植物进行光合作用，维持细胞膜的稳定性，缓解多种逆境对植物种子萌发和幼苗生长的胁迫，从而提高种子的发芽率，促进种子出苗[26]。杜利霞等[27]研究6-BA 引发对赖草种子萌发、贮藏物质和内源激素的影响，发现60 和120 mg/L 的6-BA 引发可活化种子的内源激素，在激素的作用下酶系活化，促使贮藏物质分解，为种子萌发提供营养物质，使赖草种子的发芽率达到最大值。相反，该研究中不同浓度的6-BA 溶液对竹节参种子萌发没有影响，这可能是6-BA 溶液浓度过低或过高导致的。6-BA 促进不同种子萌发的浓度存在差异，且不同植物种子对6-BA 溶液的响应敏感度也不同。

该研究中，较高浓度的GA3促进了竹节参幼苗茎的生长，但抑制了其根系生长。有研究指出，外源施用赤霉素都会造成植物茎或叶柄增长，从而使株高增高，这与笔者的研究结果类似[28]。不同浓度的IAA 处理均对竹节参幼苗根和茎的生长表现出促进趋势，但其根和茎的生长趋势呈负相关关系。此外，低浓度的6-BA 处理促进竹节参茎的生长，但对根系影响不明显，仅高浓度的6-BA 处理对根系生长有促进作用。可见，竹节参幼苗的根系和茎的生长对不同激素的响应存在差异。